The impact of transcriptional tuning on in vitro integrated rRNA transcription and ribosome construction.
The impact of transcriptional tuning on in vitro integrated rRNA transcription and ribosome construction.
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DOI：
10.1093/nar/gku307
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发表时间：
2014-06
影响因子：
14.9
通讯作者：
Jewett MC
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Fritz BR;Jewett MC
体外核糖体构建可以实现核糖体组装和功能的研究，为合成生物学构建最小细胞提供途径，并允许构建具有新功能的核糖体变体。为了实现这些长期目标，我们最近报道了一种集成的一锅核糖体 RNA 合成 (rRNA)、核糖体组装和翻译技术（称为 iSAT），用于在无核糖体 S150 粗提取物中构建大肠杆菌核糖体。在这里，我们的目标是通过转录调节来提高 iSAT 的活性。具体来说，我们通过对 rRNA 基因序列进行 3' 修饰、优化质粒和聚合酶浓度来提高转录效率，并证明使用 T7 启动的 rRNA 操纵子进行化学计量平衡的 rRNA 合成和天然 rRNA 加工。我们的修改使 iSAT 蛋白质合成活性提高了 45 倍，能够在 6 小时批量反应中合成 429 ± 15 nmol/l 绿色荧光蛋白。此外，我们表明，从 iSAT 反应纯化的核糖体的翻译活性约为直接从大肠杆菌细胞纯化的天然核糖体活性的 20%。展望未来，我们相信 iSAT 将实现独特的研究，以揭示核糖体生物发生的系统生物学，并为制造和研究核糖体变体的新方法开辟道路。
In vitro ribosome construction could enable studies of ribosome assembly and function, provide a route toward constructing minimal cells for synthetic biology, and permit the construction of ribosome variants with new functions. Toward these long-term goals, we recently reported on an integrated, one-pot ribosomal RNA synthesis (rRNA), ribosome assembly, and translation technology (termed iSAT) for the construction of Escherichia coli ribosomes in crude ribosome-free S150 extracts. Here, we aimed to improve the activity of iSAT through transcriptional tuning. Specifically, we increased transcriptional efficiency through 3′ modifications to the rRNA gene sequences, optimized plasmid and polymerase concentrations, and demonstrated the use of a T7-promoted rRNA operon for stoichiometrically balanced rRNA synthesis and native rRNA processing. Our modifications produced a 45-fold improvement in iSAT protein synthesis activity, enabling synthesis of 429 ± 15 nmol/l green fluorescent protein in 6 h batch reactions. Further, we show that the translational activity of ribosomes purified from iSAT reactions is about 20% the activity of native ribosomes purified directly from E. coli cells. Looking forward, we believe iSAT will enable unique studies to unravel the systems biology of ribosome biogenesis and open the way to new methods for making and studying ribosomal variants.
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