Identification and characterization of a highly efficient anti-HIV pol hammerhead ribozyme.
Identification and characterization of a highly efficient anti-HIV pol hammerhead ribozyme.
复制标题
高效抗 HIV pol 锤头核酶的鉴定和表征
DOI：
10.1089/oli.2008.0150
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发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
S. A. Klein
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
T. Müller-Kuller;G. Capalbo;C. Klebba;J. W. Engels;S. A. Klein
本研究的目的是鉴定并表征一种高活性的抗 HIV 核酶。因此，在 HIV-1 IIIb 的基因组中筛选了高度保守序列中尚未解决的 GUC 三联体。在这里，我们报告了最适合的抗 HIV 锤头核酶的体外特征和抗病毒活性，该核酶针对 HIV-1pol 基因 (HHPol13) 内的第 13 个 GUC 三联体。在体外测定了多重周转动力学，并揭示了非常有希望的动力学数据：Vmax= 39 nM/分钟，Km= 576 nM，kcat= 3.9/分钟，并且Kcat/Km= 6.8/分钟/μM。为了分析其抗病毒活性，锤头核酶在 Hut78 细胞中逆转录病毒表达，然后感染 HIV-1。新鉴定的核酶对 HIV-1 复制具有长期抑制作用，直至第 56 天观察期结束。我们能够证明抗病毒活性主要是由于核酶效应与有限的反义活性相结合。此外，将所鉴定的核酶的效果与针对 HIV-1pol 基因中相同靶标的逆转录病毒表达的 siRNA 进行了比较。该 siRNA (siPol13) 未显示出对 HIV 复制的抑制作用。总之，锤头状核酶 HHPol13 被证明具有针对 HIV-1 的优异切割和抗病毒活性。这些结果表明，即使在 RNAi 时代，核酶仍然具有作为高活性抗病毒剂的潜力。
The aim of this study was to identify and to characterize a highly active anti-HIV ribozyme. Therefore, the genome of HIV-1 IIIb was screened for not yet addressed GUC triplets within highly conserved sequences. Here we report thein vitrocharacteristics and the antiviral activity of the fittest identified anti-HIV hammerhead ribozyme, targeting the 13th GUC triplet within the HIV-1polgene (HHPol13). Multiple turnover kinetics were determinedin vitroand revealed very promising kinetic data:Vmax= 39 nM/minute,Km= 576 nM,kcat= 3.9/minute, andKcat/Km= 6.8/minute/μM. To analyze its antiviral activity the hammerhead ribozyme was expressed retrovirally in Hut78 cells followed by HIV-1 infection. The newly identified ribozyme conferred a long-term inhibition of HIV-1 replication until the end of the observation period at day 56. We were able to demonstrate that the antiviral activity was mainly due to a ribozyme effect combined with a limited antisense activity. Additionally, the effect of the identified ribozyme was compared with a retrovirally expressed siRNA directed against the same target in the HIV-1polgene. This siRNA (siPol13) showed no inhibition of HIV replication. In summary, the hammerhead ribozyme HHPol13 was demonstrated to confer superior cleavage and antiviral activity against HIV-1. These results suggest that even in the RNAi era ribozymes still have the potential as highly active antiviral agents.
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