A quantitative stopped-flow fluorescence assay for measuring polymerase elongation rates.
A quantitative stopped-flow fluorescence assay for measuring polymerase elongation rates.
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DOI：
10.1016/j.ab.2009.04.035
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发表时间：
2009-08-01
影响因子：
2.9
通讯作者：
Peersen OB
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Gong P;Campagnola G;Peersen OB
核酸聚合酶延伸率的测量通常通过漫长的实验过程来完成，包括放射性标记底物、淬灭延伸实验、电泳产物分离和条带定量。在这项工作中，我们描述了另一种实时停流测定，用于获取延伸序列延伸的动力学参数。该测定建立在我们早期专为高通量筛选目的而设计的 PETE 测定的基础上 (Anal. Biochem. 365, 194-200)，并依赖于测量聚合酶到达定义长度模板末端所需的时间。使用脊髓灰质炎病毒聚合酶和具有 6 至 26 个核苷酸长模板区域的自引发发夹 RNA 底物，我们证明该测定可用于确定伸长的 Vmax 速率和 NTP 利用的表观 Km 值。将反应动力学建模为一系列不可逆步骤，使我们能够通过正确考虑中间物质的时间分布来数字拟合整个基于时间的数据集。这使我们能够确定模拟病毒基因组底物的异质模板区域的平均延伸率。该测定可轻松扩展到其他 RNA 和 DNA 聚合酶，可以在模板中容纳二级结构，原则上可用于沿扩展底物移动的任何酶。
The measurement of nucleic acid polymerase elongation rates is often done via a lengthy experimental process involving radiolabeled substrates, quenched elongation experiments, electrophoretic product separation, and band quantitation. In this work we describe an alternative real-time stopped-flow assay for obtaining kinetic parameters for elongation of extended sequences. The assay builds on our earlier PETE assay designed for high-throughput screening purposes (Anal. Biochem. 365, 194-200) and relies of measuring how long it takes a polymerase to reach the end of a defined length template. Using poliovirus polymerase and self-priming hairpin RNA substrates with 6 to 26 nucleotide long templating regions, we demonstrate that the assay can be used to determine Vmax rates for elongation and apparent Km values for NTP utilization. Modeling the reaction kinetics as a series of irreversible steps allows us to numerically fit the entire time-based dataset by properly accounting for the temporal distribution of intermediate species. This enables us to determine average elongation rates over heterogeneous templating regions that mimic viral genome substrates. The assay is easily extendable to other RNA and DNA polymerases, can accommodate secondary structures in the template, and can in principle be used for any enzyme traversing along an extended substrate.
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