Targeted Genome Replacement via Homology-directed Repair in Non-dividing Cardiomyocytes.
Targeted Genome Replacement via Homology-directed Repair in Non-dividing Cardiomyocytes.
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通过非分裂心肌细胞中的同源指导修复靶向基因组替代。
DOI：
10.1038/s41598-017-09716-x
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发表时间：
2017-08-24
影响因子：
4.6
通讯作者：
Sakata Y
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Ishizu T;Higo S;Masumura Y;Kohama Y;Shiba M;Higo T;Shibamoto M;Nakagawa A;Morimoto S;Takashima S;Hikoso S;Sakata Y
虽然高通量测序可以阐明遗传性心肌病的遗传基础，但针对病理突变的直接干预措施尚未建立。此外，同源定向修复（HDR）在非分裂心肌细胞中是否有效仍不确定。在这里，我们证明使用CRISPR/Cas9进行hdr介导的基因组编辑对非分裂心肌细胞有效。将含有sgRNA和修复模板的腺相关病毒（AAV）转导到组成型表达Cas9的心肌细胞中，有效地将荧光蛋白引入Myl2的c端。基于成像的内源性标记蛋白序列评估显示，HDR发生在心肌细胞中，独立于DNA合成。我们试图修复心肌病模型小鼠心肌细胞中Tnnt2的病理突变。避免突变外显子的sgRNA对Tnnt2表达的有害影响最小化，aav介导的HDR实现了精确的基因组校正，频率约为12.5%。因此，通过HDR进行的靶向基因组替换在非分裂心肌细胞中是有效的，并且代表了针对难治性心肌病的潜在治疗工具。
Although high-throughput sequencing can elucidate the genetic basis of hereditary cardiomyopathy, direct interventions targeting pathological mutations have not been established. Furthermore, it remains uncertain whether homology-directed repair (HDR) is effective in non-dividing cardiomyocytes. Here, we demonstrate that HDR-mediated genome editing using CRISPR/Cas9 is effective in non-dividing cardiomyocytes. Transduction of adeno-associated virus (AAV) containing sgRNA and repair template into cardiomyocytes constitutively expressing Cas9 efficiently introduced a fluorescent protein to the C-terminus of Myl2. Imaging-based sequential evaluation of endogenously tagged protein revealed that HDR occurs in cardiomyocytes, independently of DNA synthesis. We sought to repair a pathological mutation in Tnnt2 in cardiomyocytes of cardiomyopathy model mice. An sgRNA that avoided the mutated exon minimized deleterious effects on Tnnt2 expression, and AAV-mediated HDR achieved precise genome correction at a frequency of ~12.5%. Thus, targeted genome replacement via HDR is effective in non-dividing cardiomyocytes, and represents a potential therapeutic tool for targeting intractable cardiomyopathy.
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DOI：
10.1038/mtna.2014.38
发表时间：
2014-08-19
期刊：
Molecular therapy. Nucleic acids
影响因子：
--
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
4.6
作者：
Hisano Y;Sakuma T;Nakade S;Ohga R;Ota S;Okamoto H;Yamamoto T;Kawahara A
通讯作者：
Kawahara A
影响因子：
64.5
作者：
Hsu PD;Lander ES;Zhang F
通讯作者：
Zhang F
影响因子：
46.9
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
16
作者：
Ciccia A;Elledge SJ
通讯作者：
Elledge SJ