Intraprotein electron transfer in inducible nitric oxide synthase holoenzyme.
Intraprotein electron transfer in inducible nitric oxide synthase holoenzyme.
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DOI：
10.1007/s00775-008-0431-2
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发表时间：
2009-01
影响因子：
3
通讯作者：
Ghosh, Dipak K.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Feng, Changjian;Dupont, Andrea L.;Nahm, Nickolas J.;Spratt, Donald E.;Hazzard, James T.;Weinberg, J. Brice;Guillemette, J. Guy;Tollin, Gordon;Ghosh, Dipak K.
黄素单核苷酸(FMN)到血红素的蛋白内电子转移(IET)在一氧化氮合酶(NOS)合成一氧化氮(NO)过程中是必不可少的。我们以前的激光闪光光解研究提供了一个直接确定FMN-heme IET在小鼠诱导型一氧化氮合酶(INOS)的氧合FMN结构中的动力学的方法，其中只存在加氧酶和FMN结构域以及钙调蛋白(CaM)结合部位[冯等人]。(2006)J.Am化学。SoC。128、3808-3811]。在这里，我们报道了人iNOS氧化FMN结构、人iNOS全酶和小鼠iNOS全酶中IET的动力学，在部分还原的NOS和缺乏FMN结构域的NOS加氧酶结构的比较研究中，我们使用了CO光解。人和小鼠诱导型一氧化氮合酶的酶促反应速率常数分别为34±5 S~(-1)和35±3 S~(-1)，从而提供了诱导型一氧化氮合酶全酶中具有催化活性的氧化还原对之间的反应强度的直接测量。这些值大约比相应的iNOS oxFMN结构中的小一个数量级，这表明在全酶中，IET中的限速步骤是从屏蔽的电子接受(输入)状态转换到新的电子给予(输出)状态。用iNOS全酶获得的动力学轨迹中没有快速的IET成分，这意味着该酶主要保持在输入状态。INOS全酶的IET速率常数与CaM结合的神经元NOS(NNOS)全酶的IET速率常数值相似，表明CaM的激活有效地消除了nNOS中独特的自我调节插入的抑制效应。
Intraprotein electron transfer (IET) from flavin mononucleotide (FMN) to heme is essential in nitric oxide (NO) synthesis by NO synthase (NOS). Our previous laser flash photolysis studies provided a direct determination of the kinetics of the FMN–heme IET in a truncated oxyFMN construct of murine inducible NOS (iNOS), in which only the oxygenase and FMN domains along with the calmodulin (CaM) binding site are present [Feng et al. (2006) J. Am. Chem. Soc. 128, 3808-3811]. Here we report the kinetics of the IET in a human iNOS oxyFMN construct, a human iNOS holoenzyme and a murine iNOS holoenzyme, using CO photolysis in comparative studies on partially reduced NOS and a NOS oxygenase construct that lacks the FMN domain. The IET rate constants for the human and murine iNOS holoenzymes are 34 ± 5 s-1 and 35 ± 3 s-1, respectively, thereby providing a direct measurement of this IET between the catalytically significant redox couples of FMN and heme in the iNOS holoenzyme. These values are approximately an order of magnitude smaller than that in the corresponding iNOS oxyFMN construct, suggesting that in the holoenzyme the rate-limiting step in the IET is the conversion of the shielded electron-accepting (input) state to a new electron-donating (output) state. The fact that there is no rapid IET component in the kinetic traces obtained with the iNOS holoenzyme implies that the enzyme remains mainly in the input state. The IET rate constant value for the iNOS holoenzyme is similar to that obtained for a CaM-bound neuronal NOS (nNOS) holoenzyme, suggesting that CaM activation effectively removes the inhibitory effect of the unique autoregulatory insert in nNOS.
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