In Situ Assembly of Transmembrane Proteins from Expressed and Synthetic Components in Giant Unilamellar Vesicles.
In Situ Assembly of Transmembrane Proteins from Expressed and Synthetic Components in Giant Unilamellar Vesicles.
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DOI：
10.1021/acschembio.2c00013
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发表时间：
2022-05-20
影响因子：
4
通讯作者：
Devaraj, N. K.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Podolsky, K. A.;Masubuchi, T.;Debelouchina, G. T.;Hui, E.;Devaraj, N. K.
由于表达疏水TM结构域的困难，将功能性跨膜（TM）蛋白重构到模型膜中是具有挑战性的，这通常需要稳定的洗涤剂，这些洗涤剂会干扰蛋白质的结构和功能。最近的模型系统通过使用非共价偶联将膜蛋白的可溶性结构域连接到脂质来解决这个问题。在此，我们测试了另一种解决方案，包括从合成的TM结构域体外组装TM蛋白，并使用化学选择性肽连接表达可溶性结构域。我们开发了一种内部介导的连接策略，通过将可溶性蛋白结构域共价连接到合成的TM多肽上，从而避免了对洗涤剂的需求，在合成的巨型单层囊泡（GUV）膜上半合成单通道TM蛋白。我们发现，哺乳动物免疫检查点受体程序性细胞死亡蛋白1的胞外结构域在与guv中合成的TM肽连接后，在膜界面保留其配体结合功能，从而促进了受体-配体相互作用的研究。
Reconstituting functional transmembrane (TM) proteins into model membranes is challenging due to the difficulty of expressing hydrophobic TM domains, which often require stabilizing detergents that can perturb protein structure and function. Recent model systems solve this problem by linking the soluble domains of membrane proteins to lipids, using non-covalent conjugation. Herein, we test an alternative solution involving the in vitro assembly of TM proteins from synthetic TM domains and expressed soluble domains using chemoselective peptide ligation. We developed an intein-mediated ligation strategy to semi-synthesize single-pass TM proteins in synthetic giant unilamellar vesicle (GUV) membranes by covalently attaching soluble protein domains to a synthetic TM polypeptide, avoiding the requirement for detergent. We show that the extracellular domain of programmed cell death protein 1, a mammalian immune checkpoint receptor, retains its ligand-binding function at a membrane interface after ligation to a synthetic TM peptide in GUVs, facilitating the study of receptor-ligand interactions.
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