Development of Transient Recombinant Expression and Affinity Chromatography Systems for Human Fibrinogen.
Development of Transient Recombinant Expression and Affinity Chromatography Systems for Human Fibrinogen.
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DOI：
10.3390/ijms23031054
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发表时间：
2022-01-19
影响因子：
5.6
通讯作者：
Hudson NE
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Popovic G;Kirby NC;Dement TC;Peterson KM;Daub CE;Belcher HA;Guthold M;Offenbacher AR;Hudson NE
纤维素是血凝块的结构支架，在生物材料方面具有巨大的应用潜力。建立纤维蛋白原（纤维蛋白原的可溶性前体）的重组表达系统将提高构建突变文库的能力，这将使纤维蛋白原的结构-功能研究成为可能，并扩大纤维蛋白作为生物材料的用途。尽管有这些需求，重组纤维蛋白原表达系统，到目前为止，依赖于耗时的稳定细胞系的创建。在这里，我们提出了一个短暂的纤维蛋白原表达系统，可以快速产生8-12 mg/L的产量使用悬浮HEK Expi 293 TM细胞的测试。我们报告的结果，从两个不同的质粒系统编码的纤维蛋白原cDNA和两种不同的转染试剂。此外，我们描述了一种新的，基于亲和力的方法来纯化纤维蛋白原从复杂的媒体，如人血浆。我们表明，使用高亲和力的肽，它模仿纤维蛋白的旋钮'A'序列，使血浆中存在的纤维蛋白原的50-75%的纯化。具有纤维蛋白原的稳健表达和纯化系统将使基础纤维蛋白（原）生物学的未来研究成为可能，同时为纤维蛋白作为生物材料的普遍使用铺平道路。
Fibrin forms the structural scaffold of blood clots and has great potential for biomaterial applications. Creating recombinant expression systems of fibrinogen, fibrin’s soluble precursor, would advance the ability to construct mutational libraries that would enable structure–function studies of fibrinogen and expand the utility of fibrin as a biomaterial. Despite these needs, recombinant fibrinogen expression systems, thus far, have relied on the time-consuming creation of stable cell lines. Here we present tests of a transient fibrinogen expression system that can rapidly generate yields of 8–12 mg/L using suspension HEK Expi293TM cells. We report results from two different plasmid systems encoding the fibrinogen cDNAs and two different transfection reagents. In addition, we describe a novel, affinity-based approach to purifying fibrinogen from complex media such as human plasma. We show that using a high-affinity peptide which mimics fibrin’s knob ‘A’ sequence enables the purification of 50–75% of fibrinogen present in plasma. Having robust expression and purification systems of fibrinogen will enable future studies of basic fibrin(ogen) biology, while paving the way for the ubiquitous use of fibrin as a biomaterial.
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