Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET.
Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET.
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DOI：
10.1083/jcb.200907029
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发表时间：
2009-11-16
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Lamond AI
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Llères D;James J;Swift S;Norman DG;Lamond AI
在独立核小体上表达荧光标记组蛋白的细胞系的FRET分析表明，有丝分裂期间染色体压实发生变化。我们提出了一种基于Förster共振能量转移（FRET）的定量分析，使用多光子荧光寿命成像显微镜（FLIM）来测量活细胞核小体阵列尺度上的染色质压实。该试验使用一种共表达组蛋白H2B的人细胞系，标记为增强的绿色荧光蛋白（FP）或mCherry FPs （HeLaH2B-2FP）。FRET发生在单独核小体上fp标记的组蛋白之间，并在染色质致密时增加。间期细胞一致显示低、中、高FRET效率的三种染色质群体，反映了染色质压缩程度不同的空间不同区域。用增加染色质压实（即三磷酸腺苷耗竭）或减少染色体压实（曲古斯汀A）的抑制剂治疗会导致flm - fret信号的平行增加或减少。在有丝分裂中，实验显示压实水平的变化，反映在不同的FRET效率群体中，在所有染色体的长度上，在后期增加到最大值。这些数据与后期发生的染色质纤维广泛的高阶折叠一致。
FRET analysis of cell lines expressing fluorescently tagged histones on separate nucleosomes demonstrates that variations in chromosome compaction occur during mitosis. We present a quantitative Förster resonance energy transfer (FRET)–based assay using multiphoton fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to measure chromatin compaction at the scale of nucleosomal arrays in live cells. The assay uses a human cell line coexpressing histone H2B tagged to either enhanced green fluorescent protein (FP) or mCherry FPs (HeLaH2B-2FP). FRET occurs between FP-tagged histones on separate nucleosomes and is increased when chromatin compacts. Interphase cells consistently show three populations of chromatin with low, medium, or high FRET efficiency, reflecting spatially distinct regions with different levels of chromatin compaction. Treatment with inhibitors that either increase chromatin compaction (i.e., depletion of adenosine triphosphate) or decrease chromosome compaction (trichostatin A) results in a parallel increase or decrease in the FLIM–FRET signal. In mitosis, the assay showed variation in compaction level, as reflected by different FRET efficiency populations, throughout the length of all chromosomes, increasing to a maximum in late anaphase. These data are consistent with extensive higher order folding of chromatin fibers taking place during anaphase.
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DOI：
10.1083/jcb.153.7.1341
发表时间：
2001-06-25
期刊：
The Journal of cell biology
影响因子：
--
作者：
Kimura H;Cook PR
通讯作者：
Cook PR
影响因子：
5.6
作者：
Huynh, VAT;Robinson, PJJ;Rhodes, D
通讯作者：
Rhodes, D
影响因子：
7.5
作者：
Belmont, AS;Dietzel, S;Tumbar, T
通讯作者：
Tumbar, T
影响因子：
3.3
作者：
Cushman, I;Stenoien, D;Moore, MS
通讯作者：
Moore, MS
影响因子：
64.5
作者：
Gilbert, N;Boyle, S;Bickmore, WA
通讯作者：
Bickmore, WA