Monitoring mammalian mitochondrial translation with MitoRiboSeq.
Monitoring mammalian mitochondrial translation with MitoRiboSeq.
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DOI：
10.1038/s41596-021-00517-1
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发表时间：
2021-06
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
Gitai Z
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Li SH;Nofal M;Parsons LR;Rabinowitz JD;Gitai Z
电子传递链的几个基本组成部分，在哺乳动物细胞中ATP的主要生产者，在线粒体基因组中编码。这13种蛋白质在线粒体内由“线粒体小体”翻译。线粒体翻译缺陷是多种先天性代谢缺陷的基础，并与衰老、代谢综合征和癌症等病理学有关。在这里，我们提供了一个详细的核糖体分析方案优化，以询问哺乳动物细胞中的线粒体翻译（MitoRiboSeq），其中mitoribosome足迹与微球菌核酸酶产生和mitoribosome从胞质核糖体和其他RNA分离通过超离心在一个简单的步骤。我们强调了文库制备过程中的关键步骤，并提供了一个循序渐进的数据分析指南，并附有开源生物信息学代码。我们的方法输出单密码子分辨率的线粒体足迹。具有高足迹密度的密码子是线粒体停滞的位点。我们最近应用这种方法来证明，线粒体丝氨酸催化剂或线粒体tRNA甲基化的缺陷会导致特定密码子处的线粒体停滞。我们的方法可以应用于研究基本的线粒体生物学或表征线粒体疾病患者的线粒体翻译异常。
Several essential components of the electron transport chain, the major producer of ATP in mammalian cells, are encoded in the mitochondrial genome. These 13 proteins are translated within mitochondria by ‘mitoribosomes’. Defective mitochondrial translation underlies multiple inborn errors of metabolism and has been implicated in pathologies such as aging, metabolic syndrome and cancer. Here, we provide a detailed ribosome profiling protocol optimized to interrogate mitochondrial translation in mammalian cells (MitoRiboSeq), wherein mitoribosome footprints are generated with micrococcal nuclease and mitoribosomes are separated from cytosolic ribosomes and other RNAs by ultracentrifugation in a single straightforward step. We highlight critical steps during library preparation and provide a step-by-step guide to data analysis accompanied by open-source bioinformatic code. Our method outputs mitoribosome footprints at single-codon resolution. Codons with high footprint densities are sites of mitoribosome stalling. We recently applied this approach to demonstrate that defects in mitochondrial serine catabolism or in mitochondrial tRNA methylation cause stalling of mitoribosomes at specific codons. Our method can be applied to study basic mitochondrial biology or to characterize abnormalities in mitochondrial translation in patients with mitochondrial disorders.
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DOI：
10.1126/science.aaa1193
发表时间：
2015-04-03
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Amunts A;Brown A;Toots J;Scheres SHW;Ramakrishnan V
通讯作者：
Ramakrishnan V
DOI：
10.1016/j.biocel.2013.12.011
发表时间：
2014-03-01
影响因子：
4
作者：
Boczonadi, Veronika;Horvath, Rita
通讯作者：
Horvath, Rita
影响因子：
56.9
作者：
Chen, Jin;Brunner, Andreas-David;Weissman, Jonathan S.
通讯作者：
Weissman, Jonathan S.
影响因子：
3.3
作者：
Fox, Thomas D.
通讯作者：
Fox, Thomas D.
影响因子：
--
作者：
Gao, Fei;Wesolowska, Maria;Chrzanowska-Lightowlers, Zofia M A
通讯作者：
Chrzanowska-Lightowlers, Zofia M A