Rapid and Scalable Preparation of Bacterial Lysates for Cell-Free Gene Expression.
Rapid and Scalable Preparation of Bacterial Lysates for Cell-Free Gene Expression.
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DOI：
10.1021/acssynbio.7b00253
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发表时间：
2017-12-15
影响因子：
4.7
通讯作者：
Hasty J
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Didovyk A;Tonooka T;Tsimring L;Hasty J
无细胞基因表达系统正在成为合成生物学和生物技术应用的一个重要平台，包括生产强大的现场就绪的生物传感器。在这里，我们将联合收割机程序化细胞自溶与冻融或冻干循环相结合，以创建一种实用的、可重复的、劳动力和成本效益高的方法，用于快速生产用于无细胞基因表达的细菌裂解物。使用这种方法，可以在没有专门设备的情况下以广泛的规模生产稳健且高活性的细菌细胞裂解物，从而使无细胞基因表达容易且广泛地获得。此外，活的自溶菌株可以直接冷冻干燥，随后在再水化时裂解以产生活性裂解物。我们通过调节蛋白质的产生和降解，实现群体感应，并显示GamS蛋白对线性DNA模板的定量保护，证明了自溶物在合成生物学中的实用性。为了允许多功能和灵敏的基于β-半乳糖苷酶（LacZ）的读出，我们产生没有可检测的背景LacZ活性的自溶物，并使用它们来产生具有LacZ介导的比色和荧光输出的灵敏的汞（II）生物传感器。自溶方法可以促进更广泛地采用无细胞技术进行无细胞基因表达以及其他合成生物学和生物技术应用，如代谢工程、天然产物生物合成或蛋白质组学。
Cell-free gene expression systems are emerging as an important platform for a diverse range of synthetic biology and biotechnology applications, including production of robust field-ready biosensors. Here, we combine programmed cellular autolysis with a freeze-thaw or freeze-dry cycle to create a practical, reproducible, and a labor- and cost-effective approach for rapid production of bacterial lysates for cell-free gene expression. Using this method, robust and highly active bacterial cell lysates can be produced without specialized equipment at a wide range of scales, making cell-free gene expression easily and broadly accessible. Moreover, live autolysis strain can be freeze-dried directly and subsequently lysed upon rehydration to produce active lysate. We demonstrate the utility of autolysates for synthetic biology by regulating protein production and degradation, implementing quorum sensing, and showing quantitative protection of linear DNA templates by GamS protein. To allow versatile and sensitive β-galactosidase (LacZ) based readout we produce autolysates with no detectable background LacZ activity and use them to produce sensitive mercury(II) biosensors with LacZ-mediated colorimetric and fluorescent outputs. The autolysis approach can facilitate wider adoption of cell-free technology for cell-free gene expression as well as other synthetic biology and biotechnology applications, such as metabolic engineering, natural product biosynthesis, or proteomics.
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DOI：
10.1016/j.bbamcr.2011.06.007
发表时间：
2012-01
期刊：
Biochimica et biophysica acta
影响因子：
--
作者：
Baker TA;Sauer RT
通讯作者：
Sauer RT
影响因子：
3.7
作者：
Fujiwara K;Nomura SM
通讯作者：
Nomura SM
影响因子：
64.5
作者：
Pardee K;Green AA;Ferrante T;Cameron DE;DaleyKeyser A;Yin P;Collins JJ
通讯作者：
Collins JJ
影响因子：
4.6
作者：
Kwon YC;Jewett MC
通讯作者：
Jewett MC
影响因子：
2.9
作者：
Pellinen, T;Huovinen, T;Karp, M
通讯作者：
Karp, M