Gold rotor bead tracking for high-speed measurements of DNA twist, torque and extension.
Gold rotor bead tracking for high-speed measurements of DNA twist, torque and extension.
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DOI：
10.1038/nmeth.2854
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发表时间：
2014-04
期刊：
影响因子：
48
通讯作者：
Bryant, Zev
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lebel, Paul;Basu, Aakash;Oberstrass, Florian C.;Tretter, Elsa M.;Bryant, Zev
DNA扭曲和延伸的同时测量已被用于测量双螺旋的物理性质，并表征核蛋白复合物的结构动力学和机械化学。然而，扭曲测量的时空分辨率受到使用具有大旋转阻力的角探头的限制，从而无法检测到短暂的中间产物或小角步长。在这里，我们介绍了AuRBT，演示了与以前的技术相比，时间分辨率提高了100倍。AuRBT采用金纳米颗粒作为明亮的低阻力旋转和拉伸探针，依靠仪器将磁镊子与物镜侧瞬变暗场显微镜相结合。在分子运动机制的初步应用中，我们研究了DNA螺旋酶的高速结构动力学，揭示了一个意想不到的瞬态中间体。AuRBT还可以直接测量DNA扭矩，比以前的技术集成时间缩短50倍；在这里，我们通过绘制z形DNA序列的构象景观来展示高分辨率扭矩光谱。
Simultaneous measurements of DNA twist and extension have been used to measure physical properties of the double helix and to characterize structural dynamics and mechanochemistry in nucleoprotein complexes. However, the spatiotemporal resolution of twist measurements has been limited by the use of angular probes with large rotational drags, preventing the detection of short-lived intermediates or small angular steps. Here we introduce AuRBT, demonstrating a >100X improvement in time resolution over previous techniques. AuRBT employs gold nanoparticles as bright low-drag rotational and extensional probes, relying on instrumentation that combines magnetic tweezers with objective-side evanescent darkfield microscopy. In an initial application to molecular motor mechanism, we have examined the high-speed structural dynamics of DNA gyrase, revealing an unanticipated transient intermediate. AuRBT also enables direct measurements of DNA torque with >50X shorter integration times than previous techniques; here we demonstrate high-resolution torque spectroscopy by mapping the conformational landscape of a Z-forming DNA sequence.
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作者：
Lee M;Lipfert J;Sanchez H;Wyman C;Dekker NH
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Dekker NH
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