Partially overlapping primer-based PCR for genome walking.
Partially overlapping primer-based PCR for genome walking.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0120139
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发表时间：
2015
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Liu X
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Li H;Ding D;Cao Y;Yu B;Guo L;Liu X
目前的基因组步移方法执行起来很麻烦，并且可能导致非特异性产物。在这里，我们展示了使用部分重叠引物PCR（POP-PCR），一个直接的基因组步行技术分离未知的侧翼区。该方法利用了一组POP引物（步移引物）的3'端的部分重叠特征，这保证了POP引物仅在相对低的温度下退火至先前PCR产物的POP位点。基因组DNA/POP位点处的POP引物适应引发仅发生一次，这是由于每个巢式PCR中的一个低严格性/降低严格性循环，导致单链DNA分子库的合成。在该池中，由于存在特异性引物结合位点，在随后的高严格循环中，靶单链DNA被复制成由特异性引物和POP引物结合的双链形式。由于不存在任何引物的结合位点，非靶单链DNA不会变成双链。因此，POP-PCR富集靶DNA，同时抑制非靶产物。我们成功地使用POP-PCR检索邻接的gadA基因座在短乳杆菌NCL 912，malQ在巴斯德毕赤酵母GS 115，人的醛缩酶A基因，和水稻hyg的侧翼区。
Current genome walking methods are cumbersome to perform and can result in non-specific products. Here, we demonstrate the use of partially overlapping primer-based PCR (POP-PCR), a direct genome walking technique for the isolation of unknown flanking regions. This method exploits the partially overlapping characteristic at the 3’ ends of a set of POP primers (walking primers), which guarantees that the POP primer only anneals to the POP site of the preceding PCR product at relatively low temperatures. POP primer adaptation priming at the genomic DNA/POP site occurs only once due to one low-/reduced-stringency cycle in each nested PCR, resulting in the synthesis of a pool of single-stranded DNA molecules. Of this pool, the target single-stranded DNA is replicated to the double-stranded form bound by the specific primer and the POP primer in the subsequent high-stringency cycle due to the presence of the specific primer-binding site. The non-target single stranded DNA does not become double stranded due to the absence of a binding site for any of the primers. Therefore, the POP-PCR enriches target DNA while suppressing non-target products. We successfully used POP-PCR to retrieve flanking regions bordering the gadA locus in Lactobacillus brevis NCL912, malQ in Pichia pastoris GS115, the human aldolase A gene, and hyg in rice.
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影响因子：
3.7
作者：
Ji J;Braam J
通讯作者：
Braam J
DOI：
10.1007/978-1-62703-715-0_12
发表时间：
2014-01-01
期刊：
CEREAL GENOMICS: METHODS AND PROTOCOLS
影响因子：
--
作者：
Shapter, Frances M.;Waters, Daniel L. E.
通讯作者：
Waters, Daniel L. E.
影响因子：
2.9
作者：
Spalinskas, R.;Van den Bulcke, M.;Milcamps, Anne
通讯作者：
Milcamps, Anne
影响因子：
2.7
作者：
Leoni, Claudia;Gallerani, Raffaele;Ceci, Luigi R.
通讯作者：
Ceci, Luigi R.
DOI：
10.1007/s004380051201
发表时间：
2000-04-01
期刊：
MOLECULAR AND GENERAL GENETICS
影响因子：
--
作者：
Terauchi, R;Kahl, G
通讯作者：
Kahl, G