Spin Labeling of Surface Cysteines Using a Bromoacrylaldehyde Spin Label.
Spin Labeling of Surface Cysteines Using a Bromoacrylaldehyde Spin Label.
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DOI：
10.1007/s00723-021-01350-1
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发表时间：
2021
影响因子：
1
通讯作者：
Fielding AJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Heaven G;Hollas MA;Tabernero L;Fielding AJ
蛋白质及其生物复合物的结构研究现在经常通过使用双电子-电子共振（DEER）光谱法通过定点自旋标记（SDSL）产生的自旋标记半胱氨酸之间的距离限制来补充。甲硫基磺酸盐自旋标记（MTSSL）在蛋白质的SDSL中已经变得普遍存在，然而，由于其大量的旋转异构体和还原性，其具有局限性。在这篇文章中，我们介绍了使用溴丙烯醛自旋标记（BASL）作为半胱氨酸自旋标记，证明了MTSSL的优势，由于其增加的表面半胱氨酸的选择性，消除了需要“敲除”多余的半胱氨酸残基。应用于多结构域蛋白质，His结构域蛋白酪氨酸磷酸酶（HD-PTP），我们表明，BASL可以很容易地添加过量的选择性标记，而MTSSL导致蛋白质沉淀。此外，使用DEER，我们能够测量HD-PTP内三个半胱氨酸结构域中的单个半胱氨酸对距离。该标记具有在三键系链中包含硫化物的进一步优点，使其成为蛋白质结合和细胞内研究的候选物。在线版本包含补充材料，可通过10.1007/s 00723 -021-01350-1获得。
Structural investigations of proteins and their biological complexes are now frequently complemented by distance constraints between spin labeled cysteines generated using double electron–electron resonance (DEER) spectroscopy, via site directed spin labeling (SDSL). Methanethiosulfonate spin label (MTSSL), has become ubiquitous in the SDSL of proteins, however, has limitations owing to its high number of rotamers, and reducibility. In this article we introduce the use of bromoacrylaldehyde spin label (BASL) as a cysteine spin label, demonstrating an advantage over MTSSL due to its increased selectivity for surface cysteines, eliminating the need to ‘knock out’ superfluous cysteine residues. Applied to the multidomain protein, His domain protein tyrosine phosphatase (HD-PTP), we show that BASL can be easily added in excess with selective labeling, whereas MTSSL causes protein precipitation. Furthermore, using DEER, we were able to measure a single cysteine pair distance in a three cysteine domain within HD-PTP. The label has a further advantage of comprising a sulfide in a three-bond tether, making it a candidate for protein binding and in-cell studies. The online version contains supplementary material available at 10.1007/s00723-021-01350-1.
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