Synthesis and conformational studies of peptides encompassing the carboxy-terminal helix of thermolysin.
Synthesis and conformational studies of peptides encompassing the carboxy-terminal helix of thermolysin.
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包含嗜热菌蛋白酶羧基末端螺旋的肽的合成和构象研究。
DOI：
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发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
A. Fontana
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
C. Vita;D. Dalzoppo;Vincenzo Filippis;R. Longhi;E. Manera;P. Pucci;A. Fontana
21个残基片段Tyr-Gly-Ser-Thr-Ser-Gln-Glu-Val-Ala-Ser-Val-Lys-Gln-Ala-Phe-Asp-Ala-Val-Gly-Val-Lys，对应于嗜热菌蛋白酶的序列296-316，因此包含天然蛋白的COOH末端螺旋片段301-312，是通过固相方法合成并通过反相高效液相色谱纯化至均质。然后用胰蛋白酶在 Lys307 处和金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶在 Glu302 处切割肽 296-316，产生额外的片段 296-307、308-316、296-302 和 303-316。通过远紫外区域的圆二色性 (CD) 测量确定，所有这些肽在中性 pH 值的水溶液中溶解时基本上是无结构的。另一方面，片段 296-316 及其一些蛋白水解片段在溶解于三氟乙醇或乙醇水溶液中时获得显着的螺旋构象。一般而言，天然嗜热菌蛋白酶中主要包含螺旋片段301-312的肽在含水醇中显示出螺旋构象。特别地，CD数据的定量分析表明，片段296-316在90%三氟乙醇水溶液中获得与天然嗜热菌蛋白酶中相应链段相同百分比（约58%）的螺旋二级结构。这些结果表明，肽 296-316 及其子片段无法在水溶液中折叠成稳定的类天然结构，这与基于分子埋藏表面积计算的嗜热菌蛋白酶 COOH 末端结构域的分离子结构域的预测位置和稳定性一致。
The 21-residue fragment Tyr-Gly-Ser-Thr-Ser-Gln-Glu-Val-Ala-Ser-Val-Lys-Gln-Ala-Phe-Asp-Ala-Val- Gly-Val-Lys, corresponding to sequence 296-316 of thermolysin and thus encompassing the COOH-terminal helical segment 301-312 of the native protein, was synthesized by solid-phase methods and purified to homogeneity by reverse-phase high performance liquid chromatography. The peptide 296-316 was then cleaved with trypsin at Lys307 and Staphylococcus aureus V8 protease at Glu302, producing the additional fragments 296-307, 308-316, 296-302, and 303-316. All these peptides, when dissolved in aqueous solution at neutral pH, are essentially structureless, as determined by circular dichroism (CD) measurements in the far-ultraviolet region. On the other hand, fragment 296-316, as well as some of its proteolytic fragments, acquires significant helical conformation when dissolved in aqueous trifluoroethanol or ethanol. In general, the peptides mostly encompassing the helical segment 301-312 in the native thermolysin show helical conformation in aqueous alcohol. In particular, quantitative analysis of CD data indicated that fragment 296-316 attains in 90% aqueous trifluoroethanol the same percentage (approximately 58%) of helical secondary structure of the corresponding chain segment in native thermolysin. These results indicate that peptide 296-316 and its subfragments are unable to fold into a stable native-like structure in aqueous solution, in agreement with predicted location and stabilities of isolated subdomains of the COOH-terminal domain of thermolysin based on buried surface area calculations of the molecule.
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