Investigation of the functional role of active site loop II in a hypoxanthine phosphoribosyltransferase.
Investigation of the functional role of active site loop II in a hypoxanthine phosphoribosyltransferase.
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研究次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶中活性位点环 II 的功能作用。
DOI：
10.1016/s0925-4439(01)00057-6
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发表时间：
2001
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Eakin,AE
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lee,CC;Medrano,FJ;Craig3rd,SP;Eakin,AE
次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 (HPRT) 具有生物医学意义，因为人类酶的缺陷可能导致痛风性关节炎或 Lesch-Nyhan 综合征，而在寄生虫中，这些酶是抗寄生虫化疗的潜在靶点。在 HPRT 中，酶催化反应期间，一个长的柔性环（活性位点环 II）在活性位点上闭合。该循环的功能作用已被提出，但尚未得到证实。在本研究中，从克氏锥虫 HPRT 环 II 中删除了 7 个氨基酸，以探讨该活性位点环在催化中的功能作用。突变酶 (Δloop II) 在细菌中表达，通过亲和层析纯化，并测定酶催化的正向（嘌呤回收）和反向（焦磷酸解）反应的底物的动力学常数。 Loop II 缺失导致焦磷酸盐 (PPi) 以外的底物的米氏常数 (Kms) 发生中等程度的变化（0.6-2.7 倍），增加了 5.8 倍。相比之下，kcat 值受到环删除的严重影响，其影响率比野生型酶低 240-840 倍。与之前报道的结构数据一起，这些结果与活性位点环 II 通过精确定位底物进行线性亲核攻击而参与过渡态稳定以及释放作为挽救反应产物的 PPia 是一致的。
Hypoxanthine phosphoribosyltransferases (HPRTs) are of biomedical interest because defects in the enzyme from humans can result in gouty arthritis or Lesch–Nyhan syndrome, and in parasites these enzymes are potential targets for antiparasite chemotherapy. In HPRTs, a long flexible loop (active site loop II) closes over the active site during the enzyme catalyzed reaction. Functional roles for this loop have been proposed but have yet to be substantiated. For the present study, seven amino acids were deleted from loop II of the HPRT from Trypanosoma cruzi to probe the functional role of this active site loop in catalysis. The mutant enzyme (Δloop II) was expressed in bacteria, purified by affinity chromatography, and kinetic constants were determined for substrates of both forward (purine salvage) and reverse (pyrophosphorolysis) reactions catalyzed by the enzyme. Loop II deletion resulted in moderate (0.6–2.7-fold) changes in the Michaelis constants (Kms) for substrates other than pyrophosphate (PPi), for which there was a 5.8-fold increase. In contrast, kcatvalues were severely affected by loop deletion, with rates that were 240–840-fold below those for the wild-type enzyme. Together with previously reported structural data, these results are consistent with active site loop II participating in transition-state stabilization by precise positioning of the substrates for in line nucleophilic attack and in the liberation of PPias a product of the salvage reaction.
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