Genome editing using FACS enrichment of nuclease-expressing cells and indel detection by amplicon analysis.
Genome editing using FACS enrichment of nuclease-expressing cells and indel detection by amplicon analysis.
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使用FACS富集表达核酸酶的细胞的基因组编辑，并通过扩增子分析进行INDEL检测。
DOI：
10.1038/nprot.2016.165
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发表时间：
2017-03
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
Frödin M
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lonowski LA;Narimatsu Y;Riaz A;Delay CE;Yang Z;Niola F;Duda K;Ober EA;Clausen H;Wandall HH;Hansen SH;Bennett EP;Frödin M
该方案描述了用于提高和评估基于CRISPR/Cas9、TALEN或ZFN的基因组编辑效率的方法。首先，通过扩增子分析的插入缺失检测（IDAA）通过在测序仪中通过毛细管电泳分析覆盖核酸酶靶位点的荧光团标记的PCR扩增子来确定由细胞、组织或胚胎中的核酸酶引起的插入和缺失的大小和频率。其次，表达与荧光蛋白连接的核酸酶的细胞的FACS富集可用于使敲除或敲入编辑效率最大化或平衡编辑效率和毒性/脱靶效应。这两种方法可以结合起来形成细胞系编辑的流水线，这有助于测试新的核酸酶试剂和生成编辑的细胞池或克隆细胞系，减少需要生成的克隆数量，并增加筛选它们的容易性。管道缩短了时间轴，但最显著的是减少了细胞系编辑的工作量。该方案提供了一个管道，用于提高和评估ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9的基因组编辑效率。该管道包括通过FACS富集核酸酶表达细胞，然后通过扩增子分析（IDAA）进行插入缺失检测。(max 250个字符）
This protocol describes methods for increasing and evaluating the efficiency of genome editing based on CRISPR/Cas9, TALENs or ZFNs. First, Indel Detection by Amplicon Analysis (IDAA) determines the size and frequency of insertions and deletions elicited by nucleases in cells, tissues or embryos through analysis of fluorophore-labelled PCR amplicons covering the nuclease target site by capillary electrophoresis in a sequenator. Second, FACS enrichment of cells expressing nucleases linked to fluorescent proteins can be used to maximize knockout or knockin editing efficiencies or balance editing efficiency and toxic/off-target effects. The two methods can be combined to form a pipeline for cell line editing, which facilitates the testing of new nuclease reagents and the generation of edited cell pools or clonal cell lines, reducing the number of clones that need to be generated and increasing the ease with which they are screened. The pipeline shortens the timeline, but most prominently reduces the workload of cell line editing. This protocol provides a pipeline with which to increase and evaluate the efficiency of genome editing by ZFNs, TALENs or CRISPR-Cas9. The pipeline comprises enrichment of nuclease expressing cells by FACS followed by Indel Detection by Amplicon Analysis (IDAA). (max 250 characters)
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影响因子：
4.4
作者：
Frank S;Skryabin BV;Greber B
通讯作者：
Greber B
DOI：
10.1093/bioinformatics/btv308
发表时间：
2015-09-15
期刊：
Bioinformatics (Oxford, England)
影响因子：
--
作者：
Hodgkins A;Farne A;Perera S;Grego T;Parry-Smith DJ;Skarnes WC;Iyer V
通讯作者：
Iyer V
影响因子：
7
作者：
Cho SW;Kim S;Kim Y;Kweon J;Kim HS;Bae S;Kim JS
通讯作者：
Kim JS
影响因子：
46.9
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
64.5
作者：
Hsu PD;Lander ES;Zhang F
通讯作者：
Zhang F