A pan-specific antibody for direct detection of protein histidine phosphorylation.
A pan-specific antibody for direct detection of protein histidine phosphorylation.
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DOI：
10.1038/nchembio.1259
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发表时间：
2013-07
影响因子：
14.8
通讯作者：
Muir, Tom W.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kee, Jung-Min;Oslund, Rob C.;Perlman, David H.;Muir, Tom W.
尽管蛋白质组氨酸磷酸化在中枢代谢和细菌细胞信号传递中具有重要作用，但由于缺乏足够的研究工具，其在生物系统中的范围和功能作用仍然难以捉摸。我们报道了第一个使用稳定的磷酸组氨酸(PHIs)模拟物作为半抗原的PAN-PHIs抗体的研制。该抗体已成功地用于ELISA、Western印迹、斑点印迹、免疫沉淀以及与质谱学分析相结合的天然细胞裂解产物中组氨酸磷酸化蛋白的检测和鉴定。我们还观察到，大肠杆菌裂解物中的蛋白质PHIs水平取决于生长介质中的碳源和氮源。特别是，我们发现PPSA上的PHIs水平对体内的氮素供应很敏感，α-酮戊二酸(α-KG)抑制了磷酸化的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(PPSA)到丙酮酸的磷酸转移。我们希望这种抗体能为研究其他PHI蛋白及其功能提供机会。
Despite its importance in central metabolism and bacterial cell signaling, protein histidine phosphorylation has remained elusive with respect to its extent and functional roles in biological systems due to the lack of adequate research tools. We report the development of the first pan-pHis antibody using a stable phosphohistidine (pHis) mimetic as the hapten. This antibody was successfully used in ELISA, Western blot, dot blot, immunoprecipitation, and in detection and identification of histidine-phosphorylated proteins from native cell lysates when coupled with mass spectrometric analysis. We also observed that protein pHis levels in E. coli lysates depend on carbon source and nitrogen availability in the growth media. In particular, we found that pHis levels on PpsA are sensitive to nitrogen availability in vivo and that α-ketoglutarate (α-KG) inhibits phosphotransfer from phosphorylated phosphoenolpyruvate synthase (PpsA) to pyruvate. We expect this antibody to open opportunities for investigating other pHis-proteins and their functions.
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