CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.
CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.
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DOI：
10.1038/nprot.2013.132
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发表时间：
2013-11
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
在全基因组范围内对基因表达进行序列特异性调控是理解基因功能和构建基因调控系统的重要途径。我们最近描述了一种基于RNA的方法，CRISPR干扰（CRISPRi），用于在细菌和人类细胞中靶向沉默转录。CRISPRi系统来源于化脓链球菌CRISPR（成簇的规则间隔回文重复序列）途径，仅需要共表达无催化活性的Cas9蛋白和可定制的单向导RNA（sgRNA）。Cas9-sgRNA复合物结合与sgRNA互补的DNA元件，并引起空间阻断，其停止RNA聚合酶的转录物延伸，导致靶基因的抑制。在这里，我们提供了用于设计、构建和表达定制的sgRNA的方案，用于转录抑制任何感兴趣的基因。我们还提供了使用定量荧光测定和天然延伸转录物测序来测试CRISPRi的阻遏活性的细节。CRISPRi提供了一种简化的方法，可以在1-2周内快速抑制基因。该方法还可以适用于全基因组基因功能和遗传相互作用的高通量询问，从而为RNA干扰提供了一种补充方法，可用于更广泛的生物体。
Sequence-specific control of gene expression on a genome-wide scale is an important approach for understanding gene functions and for engineering genetic regulatory systems. We have recently described an RNA-based method, CRISPR interference (CRISPRi), for targeted silencing of transcription in bacteria and human cells. The CRISPRi system is derived from the Streptococcus pyogenes CR ISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats) pathway, requiring only the coexpression of a catalytically inactive Cas9 protein and a customizable single guide RNA (sgRNA ). The Cas9-sgRNA complex binds to DNA elements complementary to the sgRNA and causes a steric block that halts transcript elongation by RNA polymerase, resulting in the repression of the target gene. Here we provide a protocol for the design, construction and expression of customized sgRNA s for transcriptional repression of any gene of interest. We also provide details for testing the repression activity of CRISPRi using quantitative fluorescence assays and native elongating transcript sequencing. CRISPRi provides a simplified approach for rapid gene repression within 1–2 weeks. The method can also be adapted for high-throughput interrogation of genome-wide gene functions and genetic interactions, thus providing a complementary approach to RNA interference, which can be used in a wider variety of organisms.
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Charpentier, Emmanuelle