A Rapid and Precise Mutation-Activated Fluorescence Reporter for Analyzing Acute Mutagenesis Frequency.
A Rapid and Precise Mutation-Activated Fluorescence Reporter for Analyzing Acute Mutagenesis Frequency.
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DOI：
10.1016/j.chembiol.2018.05.010
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发表时间：
2018-08-16
影响因子：
8.6
通讯作者：
Zhang F
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Birnbaum MD;Nemzow L;Kumar A;Gong F;Zhang F
突变报告基因对于量化基因组稳定性至关重要。然而，目前的方法依赖于细胞存活/死亡来报告突变，这需要数周的时间，并且无法评估急性或时间依赖性变化。现有方法还具有其他限制，例如细胞类型限制。利用我们的发现，mCherryFP荧光依赖于残基Trp 98，我们用终止密码子替换该密码子以产生突变生物传感器（称为CherryOFF），其中绿色荧光蛋白（GFP）作为内部对照。我们发现该传感器的红色荧光是由特定的A/T-G/C核苷酸转换激活的。与已建立的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶试验相比，我们的报告人具有相似或更好的检测能力，由物理/化学诱变剂或突变相关基因的操作引起的突变频率的变化。此外，CherryOFF-GFP可以独立于细胞死亡事件报告诱变，可以适应许多细胞类型，并且可以在1天内产生读数，用于测量急性或时间依赖性事件。突变激活的CherryOFF-GFP报告基因通过流式细胞术读数快速准确地反映点突变频率。该报告基因可以容易地适用于不同的点突变和插入缺失。
Mutagenesis reporters are critical for quantifying genome stability. However, current methods rely on cell survival/death to report mutation, which takes weeks and prevents evaluation of acute or time-dependent changes. Existing methods also have other limitations, such as cell type restrictions. Using our discovery that mCherryFP fluorescence depends on residue Trp98, we replaced this codon with a stop codon to generate a mutation biosensor (termed CherryOFF), with a green fluorescence protein (GFP) as an internal control. We found that the red fluorescence of this biosensor is activated by a specific A/T-G/C nucleotide transition. Compared with the established hypoxanthine phosphoribosyl transferase assay, our reporter has similar or better ability to detect changes of mutation frequency induced by physical/chemical mutagens or manipulation of mutation-related genes. Furthermore, CherryOFF-GFP can report mutagenesis independently of cell-death events, can be adapted to many cell types, and can generate readouts within 1 day for the measurement of acute or time-dependent events. The mutation-activated CherryOFF-GFP reporter quickly and accurately reflects point mutation frequency via flow cytometry readout. This reporter can easily be adapted for different point mutations and indels.
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通讯作者：
Kashlev, Mikhail