Use of a novel Förster resonance energy transfer method to identify locations of site-bound metal ions in the U2-U6 snRNA complex.
Use of a novel Förster resonance energy transfer method to identify locations of site-bound metal ions in the U2-U6 snRNA complex.
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DOI：
10.1093/nar/gkm134
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发表时间：
2007
影响因子：
14.9
通讯作者：
Greenbaum NL
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Yuan F;Griffin L;Phelps L;Buschmann V;Weston K;Greenbaum NL
U2和U6 snRNA配对以在剪接体的催化核心处形成一种遗传学上保守的复合物。与二价金属离子，特别是Mg（II），在特定的网站上的相互作用是必不可少的折叠和催化活性。我们使用了一种新的福斯特共振能量转移（FRET）的方法之间的网站绑定的发光镧系离子和共价连接的荧光染料，结合支持化学计量和突变的研究，以确定位置的网站绑定Tb（III）内的人类U2-U6复合物。在pH 7.2时，我们检测到三个金属离子结合位点：（1）共有ACACAGA序列，其形成螺旋I和III之间的内环;（2）四向连接，其包含保守的AGC三联体;和（3）U6分子内茎环（ISL）的内环。在这些位点中的每一个的结合得到先前硫代磷酸酯取代研究的支持，并且在ISL位点的情况下，得到NMR的支持。Tb（III）在四路交界处和ISL网站的结合被认为是pH值依赖性的，没有离子结合观察到低于pH值6和7，分别。金属离子结合的这种pH依赖性表明，局部环境可能在金属离子的结合中起作用，这可能影响剪接活性。
U2 and U6 snRNAs pair to form a phylogenetically conserved complex at the catalytic core of the spliceosome. Interactions with divalent metal ions, particularly Mg(II), at specific sites are essential for its folding and catalytic activity. We used a novel Förster resonance energy transfer (FRET) method between site-bound luminescent lanthanide ions and a covalently attached fluorescent dye, combined with supporting stoichiometric and mutational studies, to determine locations of site-bound Tb(III) within the human U2–U6 complex. At pH 7.2, we detected three metal-ion-binding sites in: (1) the consensus ACACAGA sequence, which forms the internal loop between helices I and III; (2) the four-way junction, which contains the conserved AGC triad; and (3) the internal loop of the U6 intra-molecular stem loop (ISL). Binding at each of these sites is supported by previous phosphorothioate substitution studies and, in the case of the ISL site, by NMR. Binding of Tb(III) at the four-way junction and the ISL sites was found to be pH-dependent, with no ion binding observed below pH 6 and 7, respectively. This pH dependence of metal ion binding suggests that the local environment may play a role in the binding of metal ions, which may impact on splicing activity.
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