Robust and Easy-to-Use One-Pot Workflow for Label-Free Single-Cell Proteomics.
Robust and Easy-to-Use One-Pot Workflow for Label-Free Single-Cell Proteomics.
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DOI：
10.1021/acs.analchem.2c05022
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发表时间：
2023-03-07
影响因子：
7.4
通讯作者：
Mechtler, Karl
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Matzinger, Manuel;Mueller, Elisabeth;Duernberger, Gerhard;Pichler, Peter;Mechtler, Karl
超低输入样本甚至单个细胞的分析对于回答众多生物医学问题至关重要，但目前的蛋白质组学工作流程在灵敏度和重现性方面受到限制。在这里，我们报告了一个全面的工作流程，包括从细胞裂解到数据分析的所有步骤的改进策略。得益于1 μL样品体积和标准化384孔板，即使是新手用户也可以轻松实施工作流程。同时，它可以使用CellenONE进行半自动化，从而实现最高的重现性。为了实现高通量，使用先进的μ柱测试了短至5分钟的超短梯度长度。对数据相关采集（DDA）、宽窗采集（WWA）、数据无关采集（DIA）和常用的高级数据分析算法进行了基准测试。使用DDA，在单个细胞中鉴定了1790个蛋白质，其动态范围为四个数量级。使用DIA，蛋白质组覆盖率增加到超过2200个蛋白质，从单细胞水平的输入，在20分钟的主动梯度。该工作流程能够区分两种细胞系，证明其适用于细胞异质性测定。
The analysis of ultralow input samples or even individual cells is essential to answering a multitude of biomedical questions, but current proteomic workflows are limited in their sensitivity and reproducibility. Here, we report a comprehensive workflow that includes improved strategies for all steps, from cell lysis to data analysis. Thanks to convenient-to-handle 1 μL sample volume and standardized 384-well plates, the workflow is easy for even novice users to implement. At the same time, it can be performed semi-automatized using CellenONE, which allows for the highest reproducibility. To achieve high throughput, ultrashort gradient lengths down to 5 min were tested using advanced μ-pillar columns. Data-dependent acquisition (DDA), wide-window acquisition (WWA), data-independent acquisition (DIA), and commonly used advanced data analysis algorithms were benchmarked. Using DDA, 1790 proteins covering a dynamic range of four orders of magnitude were identified in a single cell. Using DIA, proteome coverage increased to more than 2200 proteins identified from single-cell level input in a 20 min active gradient. The workflow enabled differentiation of two cell lines, demonstrating its suitability to cellular heterogeneity determination.
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