Conditional U1 Gene Silencing in Toxoplasma gondii.
Conditional U1 Gene Silencing in Toxoplasma gondii.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0130356
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发表时间：
2015
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Meissner M
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Pieperhoff MS;Pall GS;Jiménez-Ruiz E;Das S;Melatti C;Gow M;Wong EH;Heng J;Müller S;Blackman MJ;Meissner M
在顶复门寄生虫，如弓形虫或恶性疟原虫的必需基因的功能特性，依赖于条件诱变系统。在这里，我们提出了一种新的策略的基础上U1 snRNP介导的基因沉默。U1 snRNP通过定义外显子-内含子边界在前mRNA剪接中至关重要。当将U1识别位点置于3 '末端外显子中或邻近终止密码子时，前体mRNA在3'末端被切割并降解，导致目的基因（GOI）的有效敲低。在这里，我们描述了一种简单的方法，结合内源性标记与DiCre-mediated定位的U1识别位点附近的终止密码子的GOI，导致条件敲低后，雷帕霉素诱导的GOI。将报告基因GFP和几个T.包括网格蛋白重链基因1（chc 1）、空泡蛋白分选基因26（vps 26）和动力蛋白相关蛋白C基因（drpC）在内的弓形虫基因使用该方法沉默，并证明了该技术的潜力。我们还讨论了这种方法的优点和缺点相比，其他技术更详细。
The functional characterisation of essential genes in apicomplexan parasites, such as Toxoplasma gondii or Plasmodium falciparum, relies on conditional mutagenesis systems. Here we present a novel strategy based on U1 snRNP-mediated gene silencing. U1 snRNP is critical in pre-mRNA splicing by defining the exon-intron boundaries. When a U1 recognition site is placed into the 3’-terminal exon or adjacent to the termination codon, pre-mRNA is cleaved at the 3’-end and degraded, leading to an efficient knockdown of the gene of interest (GOI). Here we describe a simple method that combines endogenous tagging with DiCre-mediated positioning of U1 recognition sites adjacent to the termination codon of the GOI which leads to a conditional knockdown of the GOI upon rapamycin-induction. Specific knockdown mutants of the reporter gene GFP and several endogenous genes of T. gondii including the clathrin heavy chain gene 1 (chc1), the vacuolar protein sorting gene 26 (vps26), and the dynamin-related protein C gene (drpC) were silenced using this approach and demonstrate the potential of this technology. We also discuss advantages and disadvantages of this method in comparison to other technologies in more detail.
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Chen AL;Kim EW;Toh JY;Vashisht AA;Rashoff AQ;Van C;Huang AS;Moon AS;Bell HN;Bentolila LA;Wohlschlegel JA;Bradley PJ
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