High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails.
High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails.
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DOI：
10.1038/s41587-022-01418-8
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发表时间：
2023-04
影响因子：
46.9
通讯作者：
Marson, Alexander
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Shy, Brian R.;Vykunta, Vivasvan S.;Ha, Alvin;Talbot, Alexis;Roth, Theodore L.;Nguyen, David N.;Pfeifer, Wolfgang G.;Chen, Yan Yi;Blaeschke, Franziska;Shifrut, Eric;Vedova, Shane;Mamedov, Murad R.;Chung, Jing-Yi Jing;Li, Hong;Yu, Ruby;Wu, David;Wolf, Jeffrey;Martin, Thomas G.;Castro, Carlos E.;Ye, Lumeng;Esensten, Jonathan H.;Eyquem, Justin;Marson, Alexander
通过使用高浓度的具有Cas9靶序列（CTS）的双链DNA（dsDNA）的同源定向修复（HDR）来增强CRISPR介导的位点特异性转基因插入效率可能对原代细胞有毒。在这里，我们开发了单链DNA（ssDNA）HDR模板（HDRT），其掺入具有降低的毒性的CTS，其相对于dsDNA CTS提高平均约2至3倍的敲入效率和产率。使用增强HDR的小分子组合，我们可以进一步提高平均约2至3倍的敲入效率。我们的方法适用于各种目标基因座、敲入构建体和原代人类细胞类型，达到>80- 90%的HDR效率。我们证明了这种方法的应用致病基因变异建模和基因置换策略与孟德尔疾病相关的IL 2 RA和CTLA 4突变。最后，我们开发了一个良好的生产规范（GMP）兼容的非病毒嵌合抗原受体-T细胞的生产工艺，敲入效率（46-62%）和产量（>1.5 × 109个修饰细胞）超过传统方法。
Enhancing CRISPR-mediated site-specific transgene insertion efficiency by homology-directed repair (HDR) using high concentrations of double-stranded DNA (dsDNA) with Cas9 target sequences (CTSs) can be toxic to primary cells. Here, we develop single-stranded DNA (ssDNA) HDR templates (HDRTs) incorporating CTSs with reduced toxicity that boost knock-in efficiency and yield by an average of around two- to threefold relative to dsDNA CTSs. Using small-molecule combinations that enhance HDR, we could further increase knock-in efficiencies by an additional roughly two- to threefold on average. Our method works across a variety of target loci, knock-in constructs and primary human cell types, reaching HDR efficiencies of >80–90%. We demonstrate application of this approach for both pathogenic gene variant modeling and gene-replacement strategies for IL2RA and CTLA4 mutations associated with Mendelian disorders. Finally, we develop a good manufacturing practice (GMP)-compatible process for nonviral chimeric antigen receptor-T cell manufacturing, with knock-in efficiencies (46–62%) and yields (>1.5 × 109 modified cells) exceeding those of conventional approaches.
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作者：
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