CRISPR-Cas9-mediated nuclear transport and genomic integration of nanostructured genes in human primary cells.
CRISPR-Cas9-mediated nuclear transport and genomic integration of nanostructured genes in human primary cells.
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DOI：
10.1093/nar/gkac049
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发表时间：
2022-02-22
影响因子：
14.9
通讯作者：
Doudna JA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lin-Shiao E;Pfeifer WG;Shy BR;Saffari Doost M;Chen E;Vykunta VS;Hamilton JR;Stahl EC;Lopez DM;Sandoval Espinoza CR;Deyanov AE;Lew RJ;Poirer MG;Marson A;Castro CE;Doudna JA
DNA纳米结构是将分子有效载荷递送到细胞的有前途的工具。DNA折纸结构，其中长的单链DNA折叠成紧凑的纳米结构，提出了一种有吸引力的方法来包装基因;然而，有效地将遗传物质递送到细胞核中仍然是一个关键的挑战。在这里，我们描述了使用编码完整人类基因和荧光蛋白编码基因的DNA纳米结构作为紧凑模板，通过CRISPR介导的同源定向修复（HDR）进行基因整合。我们的设计包括DNA纳米结构上的CRISPR-Cas9核糖核蛋白结合位点，以增加穿梭进入细胞核。我们证明了有效的穿梭和基因组整合的DNA纳米结构使用转染和电穿孔。这些纳米结构的模板显示较低的毒性和较高的插入效率相比，非结构化的双链DNA模板在人类原代细胞。此外，我们的研究验证了病毒样颗粒作为DNA纳米结构递送的有效方法，打开了将纳米结构在体内递送到特定细胞类型的可能性。总之，这些结果为DNA纳米结构的基因递送提供了新的方法，并建立了它们作为HDR模板的用途，利用它们的设计特征和编码遗传信息的能力。这项工作也为将其他DNA纳米器件功能（如生物传感）转化为细胞核打开了一扇门。
DNA nanostructures are a promising tool to deliver molecular payloads to cells. DNA origami structures, where long single-stranded DNA is folded into a compact nanostructure, present an attractive approach to package genes; however, effective delivery of genetic material into cell nuclei has remained a critical challenge. Here, we describe the use of DNA nanostructures encoding an intact human gene and a fluorescent protein encoding gene as compact templates for gene integration by CRISPR-mediated homology-directed repair (HDR). Our design includes CRISPR–Cas9 ribonucleoprotein binding sites on DNA nanostructures to increase shuttling into the nucleus. We demonstrate efficient shuttling and genomic integration of DNA nanostructures using transfection and electroporation. These nanostructured templates display lower toxicity and higher insertion efficiency compared to unstructured double-stranded DNA templates in human primary cells. Furthermore, our study validates virus-like particles as an efficient method of DNA nanostructure delivery, opening the possibility of delivering nanostructures in vivo to specific cell types. Together, these results provide new approaches to gene delivery with DNA nanostructures and establish their use as HDR templates, exploiting both their design features and their ability to encode genetic information. This work also opens a door to translate other DNA nanodevice functions, such as biosensing, into cell nuclei.
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