Identification of valid reference genes for gene expression studies of human stomach cancer by reverse transcription-qPCR.
Identification of valid reference genes for gene expression studies of human stomach cancer by reverse transcription-qPCR.
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DOI：
10.1186/1471-2407-10-240
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发表时间：
2010-05-28
期刊：
影响因子：
3.8
通讯作者：
Goh SH
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Rho HW;Lee BC;Choi ES;Choi IJ;Lee YS;Goh SH
逆转录实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）是一种分析基因表达的有效方法。靶基因表达水平通常相对于同一样品中一致表达的参比基因（也称为内标）进行标准化。然而，迄今为止，在使用RT-qPCR寻找适合于胃癌研究的参考基因方面还没有花费太多的努力，尽管最佳参考基因的选择对于结果的解释至关重要。我们通过RT-qPCR评估了6个可能的参考基因，β-肌动蛋白（ACTB），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1（HPRT 1），β-2-微球蛋白（B2 M），核糖体亚基L29（RPL 29）和18 S核糖体RNA（18 S rRNA）在20对胃癌患者的正常和肿瘤胃组织和6个胃癌细胞系中的适用性。使用Normandy和geNorm算法进行表达稳定性分析，我们确定了这些参考基因的性能顺序及其变异值。该RT-qPCR研究显示，在“正常”与“肿瘤胃组织”中HPRT 1和18 S rRNA的表达水平存在统计学显著（p < 0.05）差异。geNorm的稳定性分析表明，B2 M-GAPDH是“胃癌细胞系”的最佳参考基因组合; RPL 29-HPRT 1是“所有胃组织”的最佳参考基因组合; ACTB-18 S rRNA是“所有胃细胞系和组织”的最佳参考基因组合。Normandy还确定B2 M为“胃癌细胞系”的最佳参考基因，RPL 29-B2 M为“所有胃组织”，18 S rRNA-ACTB为“所有胃细胞系和组织”。通过比较目标基因的归一化表达，GPNMB，发现目标基因表达的不同解释取决于最佳的单个参考基因或组合。本研究验证了RPL 29和RPL 29-B2 M作为用于“所有胃组织”的RT-qPCR分析的最佳单个参考基因和组合，以及B2 M和B2 M-GAPDH作为用于“胃癌细胞系”的最佳单个参考基因和组合。利用这些已验证的参考基因可以更准确地从转录水平上解释胃癌中基因的差异表达。
Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) is a powerful method for the analysis of gene expression. Target gene expression levels are usually normalized to a consistently expressed reference gene also known as internal standard, in the same sample. However, much effort has not been expended thus far in the search for reference genes suitable for the study of stomach cancer using RT-qPCR, although selection of optimal reference genes is critical for interpretation of results. We assessed the suitability of six possible reference genes, beta-actin (ACTB), glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1 (HPRT1), beta-2-microglobulin (B2M), ribosomal subunit L29 (RPL29) and 18S ribosomal RNA (18S rRNA) in 20 normal and tumor stomach tissue pairs of stomach cancer patients and 6 stomach cancer cell lines, by RT-qPCR. Employing expression stability analyses using NormFinder and geNorm algorithms we determined the order of performance of these reference genes and their variation values. This RT-qPCR study showed that there are statistically significant (p < 0.05) differences in the expression levels of HPRT1 and 18S rRNA in 'normal-' versus 'tumor stomach tissues'. The stability analyses by geNorm suggest B2M-GAPDH, as best reference gene combination for 'stomach cancer cell lines'; RPL29-HPRT1, for 'all stomach tissues'; and ACTB-18S rRNA, for 'all stomach cell lines and tissues'. NormFinder also identified B2M as the best reference gene for 'stomach cancer cell lines', RPL29-B2M for 'all stomach tissues', and 18S rRNA-ACTB for 'all stomach cell lines and tissues'. The comparisons of normalized expression of the target gene, GPNMB, showed different interpretation of target gene expression depend on best single reference gene or combination. This study validated RPL29 and RPL29-B2M as the best single reference genes and combination, for RT-qPCR analysis of 'all stomach tissues', and B2M and B2M-GAPDH as the best single reference gene and combination, for 'stomach cancer cell lines'. Use of these validated reference genes should provide more exact interpretation of differential gene expressions at transcription level in stomach cancer.
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