A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.
A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.
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DOI：
10.1038/nprot.2014.039
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发表时间：
2014-03
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14.8
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中科院分区：
文献类型：
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作者：
人们对使用抗体作为辅助蛋白使蛋白质结晶越来越感兴趣。在这里，我们描述了一种用于产生纳米体作为结晶伴侣的一般方案，用于柔性（膜）蛋白质及其复合物的不同构象状态的结构研究。我们的技术比其他重组结晶伴侣具有竞争优势，因为我们充分利用了天然的体液反应来对抗天然抗原。因此，我们提供了用天然蛋白免疫和通过噬菌体展示选择结合功能蛋白构象表位的体内成熟纳米体的详细方案。三个典型的例子表明，概述的程序是稳健的，能够在6到12个月的时间跨度内通过纳米体辅助x射线晶体学解决最具挑战性的蛋白质结构。
There is growing interest in using antibodies as auxiliary proteins to crystallize proteins. Here, we describe a general protocol for the generation of Nanobodies to be used as crystallization chaperones for the structural investigation of diverse conformational states of flexible (membrane) proteins and complexes thereof. Our technology has the competitive advantage over other recombinant crystallization chaperones in that we fully exploit the natural humoral response against native antigens. Accordingly, we provide detailed protocols for the immunization with native proteins and for the selection by phage display of in vivo matured Nanobodies that bind conformational epitopes of functional proteins. Three representative examples illustrate that the outlined procedures are robust, enabling to solve the structures of the most challenging proteins by Nanobody-assisted X-ray crystallography in a time span of 6 to 12 months.
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