Determination of gene expression patterns using high-throughput RNA in situ hybridization to whole-mount Drosophila embryos.
Determination of gene expression patterns using high-throughput RNA in situ hybridization to whole-mount Drosophila embryos.
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DOI：
10.1038/nprot.2009.55
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发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
Celniker, Susan E.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Weiszmann, Richard;Hammonds, Ann S.;Celniker, Susan E.
我们描述了一种对 96 孔格式的果蝇胚胎进行 RNA 原位杂交 (ISH) 的高通量方案。通过 PCR 扩增 cDNA 或基因组 DNA 模板，然后通过体外转录将地高辛标记的核糖核苷酸掺入反义 RNA 探针中。在原位杂交之前，使用 RNA 探针定量（斑点印迹）测定评估每个探针的质量。 RNA 探针与 96 孔板中固定的混合阶段果蝇胚胎杂交。染色后的胚胎可立即检查并拍照，或保存在 4°C 下以供日后分析。该方案从固定、分阶段的胚胎开始，从探针模板生产到杂交需要 6 天。固定胚胎的制备至少需要两周时间来收集代表所有阶段的胚胎。该方法已用于确定整个胚胎发生过程中 6000 多个基因的表达模式。
We describe a high-throughput protocol for RNA in situ hybridization (ISH) to Drosophila embryos in 96-well format. cDNA or genomic DNA templates are amplified by PCR and then digoxigenin-labeled ribonucleotides are incorporated into anti-sense RNA probes by in vitro transcription. The quality of each probe is evaluated prior to in situ hybridization using a RNA Probe Quantification (dot blot) assay. RNA probes are hybridized to fixed, mixed-staged Drosophila embryos in 96-well plates. The resulting stained embryos can be examined and photographed immediately or stored at 4°C for later analysis. Starting with fixed, staged embryos, the protocol takes 6 days from probe template production through hybridization. Preparation of fixed embryos requires a minimum of two weeks to collect embryos representing all stages. The method has been used to determine the expression patterns of over 6000 genes throughout embryogenesis.
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