Expression, purification, and in vitro activity of an arterivirus main proteinase.
Expression, purification, and in vitro activity of an arterivirus main proteinase.
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DOI：
10.1016/j.virusres.2006.01.025
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发表时间：
2006-09
期刊：
影响因子：
5
通讯作者：
Snijder EJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
van Aken D;Benckhuijsen WE;Drijfhout JW;Wassenaar AL;Gorbalenya AE;Snijder EJ
为了使动脉炎病毒原型马动脉炎病毒（EAV）的胰凝乳蛋白酶样“主要蛋白酶”（非结构蛋白4; nsp 4）的生化和结构表征，我们开发了在大肠杆菌中大规模生产重组nsp 4的方案。表达的nsp 4蛋白酶融合到麦芽糖结合蛋白或携带C-末端六组氨酸标签。纯化后，MBP-nsp 4的nsp 4部分成功地用于结构研究[Barrette-Ng，I.H.，Ng，K.K.S.，Mark，B.L.，货车Aken，D.，Cherney，M.M.，Garen，C，Kolodenko，Y.，Gorbalenya，A.E.，Snijder，E.J.，James，M.N.G，2002年。动脉炎病毒nsp 4的结构-最小的糜蛋白酶样蛋白酶，具有α/β C末端延伸和氧阴离子孔的交替构象。J. Biol. Chem. 277，39960-39966]。此外，两种形式的EAV蛋白酶在两种不同的反式切割测定中显示出蛋白水解活性。重组nsp 4在体外合成的底物中切割同源nsp 6/7-和nsp 7/8位点。在基于合成肽的活性测定中，研究了重组蛋白酶切割模拟6个nsp 4切割位点的P9-P7′残基的肽的潜力。代表EAV nsp 7/8连接的肽用于优化反应条件（pH 7.5，25 mM NaCl，30%甘油，30 °C），这导致在4小时内该底物的最大周转率为15%，使用底物与酶的摩尔比为24：1。本研究中描述的测定可用于EAV主要蛋白酶的更广泛的生物化学表征，包括旨在鉴定蛋白水解活性抑制剂的研究。
To allow the biochemical and structural characterization of the chymotrypsin-like “main proteinase” (non-structural protein 4; nsp4) of the arterivirus prototype Equine Arteritis Virus (EAV), we developed protocols for the large-scale production of recombinant nsp4 in Escherichia coli. The nsp4 proteinase was expressed either fused to maltose binding protein or carrying a C-terminal hexahistidine tag. Following purification, the nsp4 moiety of MBP-nsp4 was successfully used for structural studies [Barrette-Ng, I.H., Ng, K.K.S., Mark, B.L., van Aken, D., Cherney, M.M., Garen, C, Kolodenko, Y., Gorbalenya, A.E., Snijder, E.J., James, M.N.G, 2002. Structure of arterivirus nsp4—the smallest chymotrypsin-like proteinase with an alpha/beta C-terminal extension and alternate conformations of the oxyanion hole. J. Biol. Chem. 277, 39960–39966]. Furthermore, both forms of the EAV proteinase were shown to be proteolytically active in two different trans-cleavage assays. Recombinant nsp4 cleaved the cognate nsp6/7- and nsp7/8 site in in vitro synthesized substrates. In a synthetic peptide-based activity assay, the potential of the recombinant proteinase to cleave peptides mimicking the P9–P7′ residues of six nsp4 cleavage sites was investigated. The peptide representing the EAV nsp7/8 junction was used to optimize the reaction conditions (pH 7.5, 25 mM NaCl, 30% glycerol at 30 °C), which resulted in a maximum turnover of 15% of this substrate in 4 h, using a substrate to enzyme molar ratio of 24:1. The assays described in this study can be used for a more extensive biochemical characterization of the EAV main proteinase, including studies aiming to identify inhibitors of proteolytic activity.
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影响因子：
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Lai MM
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10.1074/jbc.m311744200
发表时间：
2004-06-04
期刊：
The Journal of biological chemistry
影响因子：
--
作者：
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Song J
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作者：
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作者：
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通讯作者：
SPAAN, WJM