Analysis of RNA conformation in endogenously assembled RNPs by icSHAPE.
Analysis of RNA conformation in endogenously assembled RNPs by icSHAPE.
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DOI：
10.1016/j.xpro.2021.100477
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发表时间：
2021-06-18
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Artandi SE
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chen L;Chang HY;Artandi SE
哺乳动物基因组的大部分被转录为非编码 RNA，其中许多与 RNA 结合蛋白 (RBP) 共同进化，以生化定义且易于处理的核糖核蛋白 (RNP) 的形式发挥作用。在这里，我们将 icSHAPE（一种强大且多功能的 RNA 结构探测管道）应用于从细胞核纯化的内源性 RNP，为 RNP 活性和亚细胞定位提供碱基分辨率的结构原理。结合遗传和生化重建，结构和功能的改变可以直接归因于给定的 RBP，没有歧义。有关该协议的使用和执行的完整详细信息，请参阅。无去垢剂提取具有高溶解度和比活性的天然 RNP 亲和纯化目标 RNP，以提高 icSHAPE 覆盖率和重现性 CRISPR-KO 和生化重构以操纵 RBP 的占据 明确地将 RNA 中的结构足迹分配给特定的 RBP 亚基 大多数哺乳动物基因组被转录为非编码 RNA，其中许多与 RNA 结合蛋白 (RBP) 共同进化，发挥作为生化明确且易于处理的核糖核蛋白（RNP）。在这里，我们将 icSHAPE（一种强大且多功能的 RNA 结构探测管道）应用于从细胞核纯化的内源性 RNP，为 RNP 活性和亚细胞定位提供碱基分辨率的结构原理。结合遗传和生化重建，结构和功能的改变可以直接归因于给定的 RBP，没有歧义。
The majority of the mammalian genome is transcribed into non-coding RNAs, many of which co-evolve with RNA-binding proteins (RBPs) to function as biochemically defined and tractable ribonucleoproteins (RNPs). Here, we applied icSHAPE- a robust and versatile RNA structural probing pipeline- to endogenous RNPs purified from nuclei, providing base-resolution structural rationale for RNP activity and subcellular localization. Combining with genetic and biochemical reconstitutions, structural and functional alternations can be directly attributed to a given RBP without ambiguity. For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to. Detergent-free extraction for native RNPs with high solubility and specific activity Affinity purify target RNPs to improve icSHAPE coverage and reproducibility CRISPR-KO and biochemical reconstitution to manipulate RBP’s occupancy Unambiguously assign structural footprints in the RNA to specific RBP subunits The majority of the mammalian genome is transcribed into non-coding RNAs, many of which co-evolve with RNA-binding proteins (RBPs) to function as biochemically defined and tractable ribonucleoproteins (RNPs). Here, we applied icSHAPE, a robust and versatile RNA structural probing pipeline, to endogenous RNPs purified from nuclei, providing base-resolution structural rationale for RNP activity and subcellular localization. Combining with genetic and biochemical reconstitutions, structural, and functional alternations can be directly attributed to a given RBP without ambiguity.
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影响因子：
64.5
作者：
Venteicher, Andrew S.;Meng, Zhaojing;Artandi, Steven E.
通讯作者：
Artandi, Steven E.
影响因子：
5.3
作者：
Stern, J. Lewis;Zyner, Katherine G.;Bryan, Tracy M.
通讯作者：
Bryan, Tracy M.
DOI：
10.3791/52118
发表时间：
2015-01-03
期刊：
Journal of visualized experiments : JoVE
影响因子：
--
作者：
Bauer DE;Canver MC;Orkin SH
通讯作者：
Orkin SH
影响因子：
14.8
作者：
Flynn RA;Zhang QC;Spitale RC;Lee B;Mumbach MR;Chang HY
通讯作者：
Chang HY
影响因子：
14.8
作者：
Ran, F. Ann;Hsu, Patrick D.;Zhang, Feng
通讯作者：
Zhang, Feng