ddPCR allows 16S rRNA gene amplicon sequencing of very small DNA amounts from low-biomass samples.
ddPCR allows 16S rRNA gene amplicon sequencing of very small DNA amounts from low-biomass samples.
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DOI：
10.1186/s12866-021-02391-z
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发表时间：
2021-12-18
期刊：
影响因子：
4.2
通讯作者：
Neuhaus K
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Abellan-Schneyder I;Schusser AJ;Neuhaus K
短扩增子16S rRNA基因测序方法的一个限制因素是在扩增子生成步骤中使用低DNA量。特别是对于低生物量样品，DNA数量不足甚至通常无法检测到可能限制或禁止在标准方案中进行进一步分析。使用新建立的方案，与标准方案相比，发现非常低的DNA输入量足以使用16S rRNA基因测序可靠地检测细菌。改进的方案包括使用数字液滴PCR优化的扩增策略。我们演示了PCR产物是如何产生的，即使使用非常低浓度的DNA，无法通过使用量子位检测。重要的是，与使用高或极低的初始DNA量相比，使用不同的16S rRNA基因引物对最终的分类图谱有更大的影响。我们改进的方案利用了ddPCR，并允许忠实地扩增非常低数量的模板。这样，低细菌生物量的样品就可以与高细菌量的样品相媲美，因为第一步和大多数偏倚步骤是相同的。此外，必须说明所使用的DNA浓度和体积，并包括指示分类概况可能发生变化的阴性对照。尽管如此，使用不同引物对产生的结果不容易比较。在线版本包含补充材料，可在10.1186/s12866-021-02391-z获得。
One limiting factor of short amplicon 16S rRNA gene sequencing approaches is the use of low DNA amounts in the amplicon generation step. Especially for low-biomass samples, insufficient or even commonly undetectable DNA amounts can limit or prohibit further analysis in standard protocols. Using a newly established protocol, very low DNA input amounts were found sufficient for reliable detection of bacteria using 16S rRNA gene sequencing compared to standard protocols. The improved protocol includes an optimized amplification strategy by using a digital droplet PCR. We demonstrate how PCR products are generated even when using very low concentrated DNA, unable to be detected by using a Qubit. Importantly, the use of different 16S rRNA gene primers had a greater effect on the resulting taxonomical profiles compared to using high or very low initial DNA amounts. Our improved protocol takes advantage of ddPCR and allows faithful amplification of very low amounts of template. With this, samples of low bacterial biomass become comparable to those with high amounts of bacteria, since the first and most biasing steps are the same. Besides, it is imperative to state DNA concentrations and volumes used and to include negative controls indicating possible shifts in taxonomical profiles. Despite this, results produced by using different primer pairs cannot be easily compared. The online version contains supplementary material available at 10.1186/s12866-021-02391-z.
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