Single-cell mechanogenetics using monovalent magnetoplasmonic nanoparticles.
Single-cell mechanogenetics using monovalent magnetoplasmonic nanoparticles.
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DOI：
10.1038/nprot.2017.071
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发表时间：
2017-09
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
Cheon J
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kim JW;Seo D;Lee JU;Southard KM;Lim Y;Kim D;Gartner ZJ;Jun YW;Cheon J
在单细胞水平上对信号转导的时空询问对于回答许多重要的生物学问题是必要的。该协议描述了一种基于纳米技术的单细胞和单分子扰动工具，称为mechanogenetics，它能够精确的空间和机械控制活细胞中的遗传编码的细胞表面受体。该工具的关键组件是磁等离子体纳米颗粒（MPN）致动器，通过目标特定的一对一接合向受体提供定义的空间和机械提示，以及远程控制施加在单个MPN上的力的大小的微磁镊子（µMT）。本方案由三个主要部分组成：（1）准备小（40-50 nm）、单价和模块化MPN探针，包括MPN纳米颗粒的化学合成、与DNA的缀合和单价MPN的纯化，2）μMT设置和作为μ MT至MPN距离的函数的单颗粒力校准，和3）通过调节µ MT-至-MPN距离控制活细胞中靶向机械敏感受体的空间和机械性质。使用苄基鸟嘌呤功能化的MPN和表达SNAP标记的Notch或血管内皮钙粘蛋白（VE-钙粘蛋白）的模型细胞系，我们提供了逐步的指令，用于受体聚集或机械活化的机械遗传控制。这种方法的能力，差异控制的空间和机械输入的目标受体，使其特别有用的询问每个单独的线索对细胞信号的差异贡献。整个过程需要长达1周。该工具具有多方面的应用，涵盖基础生物科学和应用生物科学。
Spatiotemporal interrogation of signal transduction at the single cell level is necessary to answer a host of important biological questions. This protocol describes a nanotechnology-based single-cell and single-molecule perturbation tool, termed mechanogenetics, that enables precise spatial and mechanical control over genetically encoded cell-surface receptors in live cells. The key components of this tool are a magnetoplasmonic nanoparticle (MPN) actuator that delivers defined spatial and mechanical cues to receptors through target-specific one-to-one engagement, and a micromagnetic tweezers (µMT) that remotely controls the magnitude of force exerted on a single MPN. This protocol consists of three major parts: 1) Preparation of small (40–50 nm), monovalent, and modular MPN probes, including chemical synthesis of MPN nanoparticles, conjugation with DNA, and purification of monovalent MPNs, 2) µMT setup and single particle force calibration as a function of µMT-to-MPN distance, and 3) control of spatial and mechanical properties of targeted mechanosensitive receptors in live cells by adjusting the µMT-to-MPN distance. Using benzylguanine-functionalized MPNs and model cell lines expressing either SNAP-tagged Notch or vascular endothelial cadherin (VE-cadherin), we provide stepwise instructions for mechanogenetic control of receptor clustering or mechanical activation. The ability of this method to differentially control spatial and mechanical inputs to targeted receptors makes it particularly useful for interrogating the differential contributions of each individual cue on cell signaling. The entire procedure takes up to 1 week. This tool has versatile applications spanning the basic to applied biological sciences.
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