Integration of FRET and sequencing to engineer kinase biosensors from mammalian cell libraries.
Integration of FRET and sequencing to engineer kinase biosensors from mammalian cell libraries.
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DOI：
10.1038/s41467-021-25323-x
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发表时间：
2021-08-19
影响因子：
16.6
通讯作者：
Wang Y
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Liu L;Limsakul P;Meng X;Huang Y;Harrison RES;Huang TS;Shi Y;Yu Y;Charupanit K;Zhong S;Lu S;Zhang J;Chien S;Sun J;Wang Y
福斯特共振能量转移 (FRET) 生物传感器的有限灵敏度阻碍了其更广泛的应用。在这里，我们开发了一种集成高通量 FRET 分选和新一代测序 (FRET-Seq) 的方法，利用自激活 FRET (saFRET) 生物传感器的设计，直接从哺乳动物细胞中的大规模文库中识别具有不同底物序列的敏感生物传感器。由此产生的 Fyn 和 ZAP70 激酶生物传感器表现出增强的性能，并能够对 T 细胞受体 (TCR) 或嵌合抗原受体 (CAR) 介导的 T 细胞激活进行动态成像，揭示了 TCR 而非 CAR 参与时高度组织化的 ZAP70 亚细胞活性模式。 ZAP70 生物传感器阐明了免疫受体酪氨酸激活基序 (ITAM) 在影响 ZAP70 激活以调节 CAR 功能中的作用。基于 saFRET 生物传感器的高通量药物筛选 (saFRET-HTDS) 测定进一步能够鉴定 FDA 批准的抗癌药物舒尼替尼 (Sunitinib)，该药物可重新用于抑制 ZAP70 活性和自身免疫性疾病相关 T 细胞激活。现有的福斯特共振能量转移 (FRET) 生物传感器的灵敏度通常受到限制。在这里，作者报告了 FRET-seq，他们用它来识别性能增强的 Fyn 和 ZAP70 激酶生物传感器，并用它们对 T 细胞激活进行成像和筛选药物。
The limited sensitivity of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors hinders their broader applications. Here, we develop an approach integrating high-throughput FRET sorting and next-generation sequencing (FRET-Seq) to identify sensitive biosensors with varying substrate sequences from large-scale libraries directly in mammalian cells, utilizing the design of self-activating FRET (saFRET) biosensor. The resulting biosensors of Fyn and ZAP70 kinases exhibit enhanced performance and enable the dynamic imaging of T-cell activation mediated by T cell receptor (TCR) or chimeric antigen receptor (CAR), revealing a highly organized ZAP70 subcellular activity pattern upon TCR but not CAR engagement. The ZAP70 biosensor elucidates the role of immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) in affecting ZAP70 activation to regulate CAR functions. A saFRET biosensor-based high-throughput drug screening (saFRET-HTDS) assay further enables the identification of an FDA-approved cancer drug, Sunitinib, that can be repurposed to inhibit ZAP70 activity and autoimmune-disease-related T-cell activation. Existing Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors are often limited in their sensitivity. Here the authors report FRET-seq which they use to identify Fyn and ZAP70 kinase biosensors with enhanced performance, and use them to image T-cell activation and screen drugs.
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影响因子：
7.3
作者：
Filipp D;Ballek O;Manning J
通讯作者：
Manning J
影响因子：
48
作者：
Fowler, Douglas M.;Fields, Stanley
通讯作者：
Fields, Stanley
DOI：
10.1016/j.bbrc.2015.02.117
发表时间：
2015-04-10
影响因子：
3.1
作者：
Cadra, Sophie;Gucciardi, Alexia;Lellouch, Annemarie C.
通讯作者：
Lellouch, Annemarie C.
影响因子：
3.5
作者：
Ibraheem A;Yap H;Ding Y;Campbell RE
通讯作者：
Campbell RE
影响因子：
4
作者：
Brandvold, Kristoffer R.;Steffey, Michael E.;Fox, Christel C.;Soellner, Matthew B.
通讯作者：
Soellner, Matthew B.