A Streptomyces venezuelae Cell-Free Toolkit for Synthetic Biology.
A Streptomyces venezuelae Cell-Free Toolkit for Synthetic Biology.
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DOI：
10.1021/acssynbio.0c00581
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发表时间：
2021-02-19
影响因子：
4.7
通讯作者：
Freemont PS
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Moore SJ;Lai HE;Chee SM;Toh M;Coode S;Chengan K;Capel P;Corre C;de Los Santos EL;Freemont PS
原核细胞无细胞偶联转录-翻译（TX-TL）系统正在成为一种强有力的工具，用于在试管中检测天然产物的生物合成途径。该方法的主要优点是缩短了实验时间尺度和控制反应条件。为了实现这一潜力，必须在生物体中开发专门的无细胞系统，以丰富生物合成基因簇。这需要强大的蛋白质生产和特性良好的合成生物学工具。链霉菌属是天然产物的主要来源。为了研究链霉菌的酶和途径，我们最初开发了一个同源链霉菌无细胞系统，以提供天然蛋白质折叠环境，高G+C (%) tRNA池和活跃的背景代谢。然而，我们的初始产率很低（36 μg/mL），并且批与批之间的差异很大。在这里，我们提出了一个更新的高产、稳健的链霉菌TX-TL方案，达到266 μg/mL的表达重组蛋白的产量。为了补充这一点，我们用不同的报告基因快速表征了一系列DNA部分，表达了高G+C（%）的生物合成基因，并初步证明了链霉菌代谢途径在单一“一锅”反应中结合转录、翻译和生物合成的概念。
Prokaryotic cell-free coupled transcription–translation (TX-TL) systems are emerging as a powerful tool to examine natural product biosynthetic pathways in a test tube. The key advantages of this approach are the reduced experimental time scales and controlled reaction conditions. To realize this potential, it is essential to develop specialized cell-free systems in organisms enriched for biosynthetic gene clusters. This requires strong protein production and well-characterized synthetic biology tools. The Streptomyces genus is a major source of natural products. To study enzymes and pathways from Streptomyces, we originally developed a homologous Streptomyces cell-free system to provide a native protein folding environment, a high G+C (%) tRNA pool, and an active background metabolism. However, our initial yields were low (36 μg/mL) and showed a high level of batch-to-batch variation. Here, we present an updated high-yield and robust Streptomyces TX-TL protocol, reaching up to yields of 266 μg/mL of expressed recombinant protein. To complement this, we rapidly characterize a range of DNA parts with different reporters, express high G+C (%) biosynthetic genes, and demonstrate an initial proof of concept for combined transcription, translation, and biosynthesis of Streptomyces metabolic pathways in a single “one-pot” reaction.
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