A Novel Cell Fixation Method that Greatly Enhances Protein Identification in Microproteomic Studies Using Laser Capture Microdissection and Mass Spectrometry.
A Novel Cell Fixation Method that Greatly Enhances Protein Identification in Microproteomic Studies Using Laser Capture Microdissection and Mass Spectrometry.
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DOI：
10.1002/pmic.201700294
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发表时间：
2018-06
期刊：
影响因子：
3.4
通讯作者：
Gousset K
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Gordon A;Kannan SK;Gousset K
微蛋白质组学研究提高了我们对细胞生物学的认识。然而，使用质谱（MS）分析，当使用异质样品时，可能会失去蛋白质鉴定和定量的准确性。激光捕获显微解剖（LCM）允许富集特定的细胞亚群来研究它们的蛋白质组；然而，样品固定是必要的。不幸的是，由于蛋白质交联，固定会妨碍MS结果。本研究的目的是确定一种固定方案和一种提取方法，在保留细胞结构的同时，为下游的质谱分析提供最佳的蛋白质产量。我们比较了戊二醛（GLU），一种保存细胞的常用固定剂，和二硫代双丙酸酯（DTBP），一种可切割的交联剂。我们的DTBP固定/提取方案大大提高了蛋白质回收率。事实上，1000个GLU固定细胞从收集的1994个独特光谱的1464个独特肽中只获得159个独特的蛋白质点，而1000个DTBP固定细胞从收集的10,401个独特光谱的7542个独特肽中获得567个独特的蛋白质点。也就是说，蛋白质命中增加了3.57倍，独特肽增加了5.15倍，独特收集光谱增加了5.22倍。总体而言，本文介绍的新方案允许在使用LCM采集样品后，对MS进行非常有效的蛋白质回收和良好的样品质量。
Microproteomic studies have improved our knowledge of cell biology. Yet, with mass spectrometry (MS) analysis, accuracy can be lost for protein identification and quantification when using heterogeneous samples. Laser capture microdissection (LCM) allows for the enrichment of specific subsets of cells to study their proteome; however, sample fixation is necessary. Unfortunately, fixation hampers MS results due to protein cross-linking. The aim of this study was to identify both a fixation protocol and an extraction method that returns the best yield of proteins for downstream MS analysis, while preserving cellular structures. We compared glutaraldehyde (GLU), a common fixative to preserve cells, to dithiobispropionimidate (DTBP), a cleavable cross-linker. Our DTBP fixation/extraction protocol greatly increased the protein recovery. In fact, while 1000 GLU fixed cells returned only 159 unique protein hits, from 1464 unique peptides of 1994 unique collected spectra, 1000 DTBP fixed cells resulted in 567 unique collected protein hits, from 7542 unique peptides, of 10,401 unique collected spectra. That is, a 3.57-fold increase in protein hits, 5.15-fold increase in unique peptides, and a 5.22-fold increase in unique collected spectra. Overall, the novel protocol introduced here allows for a very efficient protein recovery and good sample quality for MS after sample collection using LCM.
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影响因子：
3.2
作者：
Shi, Shan-Rong;Liu, Cheng;Taylor, Clive R.
通讯作者：
Taylor, Clive R.
DOI：
10.1074/mcp.m111.014050
发表时间：
2012-03
期刊：
Molecular & cellular proteomics : MCP
影响因子：
--
作者：
Geiger T;Wehner A;Schaab C;Cox J;Mann M
通讯作者：
Mann M
影响因子：
4
作者：
Gousset, Karine;Marzo, Ludovica;Zurzolo, Chiara
通讯作者：
Zurzolo, Chiara
影响因子：
4.3
作者：
Brioschi, Maura;Eligini, Sonia;Banfi, Cristina
通讯作者：
Banfi, Cristina
DOI：
10.1007/978-1-4939-0685-7_14
发表时间：
2014-01-01
期刊：
SHOTGUN PROTEOMICS: METHODS AND PROTOCOLS
影响因子：
--
作者：
Arike, Liisa;Peil, Lauri
通讯作者：
Peil, Lauri