Single-molecule pull-down for studying protein interactions.
Single-molecule pull-down for studying protein interactions.
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DOI：
10.1038/nprot.2011.452
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发表时间：
2012-02-09
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
本协议描述了一种单分子下拉（SiMPull）分析生理蛋白复合物的方法。该分析结合了传统的下拉分析与单分子全内反射荧光显微镜，并允许探测单个大分子复合物直接从细胞或组织提取物。在这种方法中，针对目标蛋白的抗体被固定在钝化的显微镜载玻片上。当应用细胞提取物时，表面绑定抗体捕获蛋白质及其生理相互作用伙伴。洗去未结合的成分后，用单分子荧光显微镜探测被拉下的蛋白质。捕获的蛋白质通过基因编码的荧光蛋白标签或通过抗体标记可视化。与western blot分析相比，这种超灵敏的分析方法需要的试剂至少少10倍，速度快得多，并能提供定量数据。此外，SiMPull可以区分同一蛋白的多个关联状态。SiMPull一般适用于各种细胞背景下的蛋白质和内源性蛋白质。从细胞提取液和钝化载玻片开始，该试验需要1.5 - 2.5小时进行数据采集和分析。
This protocol describes a single molecule pull-down (SiMPull) assay for analyzing physiological protein complexes. The assay combines the conventional pull-down assay with single molecule total internal reflection fluorescence microscopy, and allows probing single macromolecular complexes directly from cell or tissue extracts. In this method, antibodies against the protein of interest are immobilized on a passivated microscope slide. When cell extracts are applied, the surface-tethered antibody captures the protein together with its physiological interaction partners. After washing away the unbound components, single molecule fluorescence microscopy is used to probe the pulled down proteins. Captured proteins are visualized through genetically encoded fluorescent protein tags or through antibody labeling. This ultra-sensitive assay requires at least 10-fold less reagents, is significantly faster and provides quantitative data compared to western blot analysis. Furthermore, SiMPull can distinguish between multiple association states of the same protein. SiMPull is generally applicable to proteins from a variety of cellular contexts and to endogenous proteins. Starting with the cell extracts and passivated slides, the assay requires 1.5 – 2.5 hours for data acquisition and analysis.
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影响因子：
7.4
作者：
Li, HT;Zhou, DJ;Klenerman, D
通讯作者：
Klenerman, D
DOI：
10.1126/science.1198830
发表时间：
2011-03-11
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Hoskins AA;Friedman LJ;Gallagher SS;Crawford DJ;Anderson EG;Wombacher R;Ramirez N;Cornish VW;Gelles J;Moore MJ
通讯作者：
Moore MJ
DOI：
10.1007/978-1-60327-355-8_3
发表时间：
2010-01-01
期刊：
HELICASES: METHODS AND PROTOCOLS
影响因子：
--
作者：
Rothenberg, Eli;Ha, Taekjip
通讯作者：
Ha, Taekjip
DOI：
10.1073/pnas.0401690101
发表时间：
2004-06-15
影响因子：
11.1
作者：
Kapanidis, AN;Lee, NK;Weiss, S
通讯作者：
Weiss, S
影响因子：
48
作者：
Ulbrich, Maximilian H.;Isacoff, Ehud Y.
通讯作者：
Isacoff, Ehud Y.