Isolating photoreceptor compartment-specific protein complexes for subsequent proteomic analysis.
Isolating photoreceptor compartment-specific protein complexes for subsequent proteomic analysis.
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分离光感受器区室特异性蛋白质复合物以进行后续蛋白质组分析。
DOI：
10.1007/978-1-4614-0631-0_89
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发表时间：
2012
影响因子：
--
通讯作者：
Hagstrom,StephanieA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Grossman,GregoryH;Pauer,GayleJT;Hoppe,George;Hagstrom,StephanieA
Tulp1是一种光感受器特异性蛋白，可能执行两种不同的功能，一种在内节(IS)，另一种在突触中。为了区分Tulp1在光感受器中的作用，我们开发了一种捕获隔室特定复合体的方法，用于后续的蛋白质分析。利用体内灌流，我们将蛋白质交联以保存内源性蛋白质复合体。用激光显微解剖技术从视网膜切片上采集3个室组织标本：包含光感受器突触的外丛状层(OPL)和作为非Tulp1对照组织的内丛状层(IPL)。对特定视网膜和整个视网膜样本进行匀浆，并进行蛋白质印迹分析。我们的分析表明，一条约78 kDa的条带标记wt交联体组织中的天然Tulp1，但不标记tulp1−/−交联体。在wt匀浆中，在Tulp180kDa和Tulp1280 kDa处还检测到两条额外的条带，表明∼复合体的存在。最后，在IS分离的样品中存在与280 kDa条带匹配的条带，而在OPL分离的样品中没有，这表明IS隔室特异的Tulp1复合体。
Tulp1 is a photoreceptor-specific protein that may perform two distinct functions, one in the inner segment (IS) and another in the synapse. To differentiate the roles of Tulp1 in the photoreceptor, we developed a methodology for the capture of compartment-specific complexes for subsequent protein analysis. Using in vivo perfusion, we crosslinked proteins to conserve endogenous protein complexes. Laser microdissection was used to collect three compartment tissue samples from retinal sections: the IS, the outer plexiform layer (OPL) containing the photoreceptor synapses, and the inner plexiform layer (IPL), serving as a Tulp1-free control tissue. Compartment-specific as well as whole retinal samples were homogenized and subjected to Western blot analysis. Our analysis showed that a band at approximately 78 kDa labels native Tulp1 in the wt crosslinked tissue, but nottulp1−/−crosslinked tissue. Two additional bands were detected at ∼180 and ∼280 kDa in wt homogenate, indicating the presence of Tulp1 complexes. Finally, a band matching the 280 kDa band was present in the IS-isolated sample, but not the OPL-isolated sample, indicating an IS compartment-specific Tulp1 complex.
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