Molecular goniometers for single-particle cryo-electron microscopy of DNA-binding proteins.
Molecular goniometers for single-particle cryo-electron microscopy of DNA-binding proteins.
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用于DNA结合蛋白的单颗粒低温电子显微镜的分子测角仪。
DOI：
10.1038/s41587-020-0716-8
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发表时间：
2021-03
影响因子：
46.9
通讯作者：
Douglas SM
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Aksel T;Yu Z;Cheng Y;Douglas SM
用低温电子显微镜(Cryo-EM)正确重建大分子结构依赖于对单粒子图像取向的准确确定。对于小的(<；100 kDa)DNA结合蛋白，获得具有足够不对称特征的颗粒图像以正确指导比对是具有挑战性的。我们应用DNA折纸来构建分子测角仪-精确定位物体的仪器-并使用它们将DNA结合蛋白对接在具有用户可编程倾斜和旋转角度的双螺旋平台上。我们构建了具有14个不同阶段配置的测角器，以定位和可视化冷冻-EM网格表面上方的蛋白质。每个测角仪都有一个不同的条形码图案，我们在颗粒分类过程中使用它来为结合的蛋白质分配角度优先。我们使用测角仪获得了Burrh的6.5？结构，Burrh是一种82 kDa的DNA结合蛋白，其螺旋的假对称阻碍了使用传统的低温EM进行准确的图像定位。我们的方法应该适用于其他DNA结合蛋白以及融合到DNA结合结构域的小蛋白。DNA折纸在表面定向单个蛋白质，以帮助通过冷冻电子显微镜确定结构。
Correct reconstruction of macromolecular structure by cryo-electron microscopy (cryo-EM) relies on accurate determination of the orientation of single-particle images. For small (<100 kDa) DNA-binding proteins, obtaining particle images with sufficiently asymmetric features to correctly guide alignment is challenging. We apply DNA origami to construct molecular goniometers—instruments that precisely orient objects—and use them to dock a DNA-binding protein on a double-helix stage that has user-programmable tilt and rotation angles. We construct goniometers with fourteen different stage configurations to orient and visualize the protein just above the cryo-EM grid surface. Each goniometer has a distinct barcode pattern that we use during particle classification to assign angle priors to the bound protein. We use goniometers to obtain a 6.5 Å structure of BurrH, an 82-kDa DNA-binding protein whose helical pseudosymmetry prevents accurate image orientation using traditional cryo-EM. Our approach should be adaptable to other DNA-binding proteins as well as small proteins fused to DNA-binding domains. DNA origami orients single proteins on a surface to aid structure determination by cryo-electron microscopy.
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