Photolabeling of membrane-bound Torpedo nicotinic acetylcholine receptor with the hydrophobic probe 3-trifluoromethyl-3-(m-[125I]iodophenyl)diazirine.
Photolabeling of membrane-bound Torpedo nicotinic acetylcholine receptor with the hydrophobic probe 3-trifluoromethyl-3-(m-[125I]iodophenyl)diazirine.
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使用疏水性探针 3-三氟甲基-3-(间-[125I]碘苯基)二氮丙啶对膜结合鱼雷烟碱乙酰胆碱受体进行光标记。
DOI：
10.1021/bi00424a009
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发表时间：
1988
期刊：
影响因子：
2.9
通讯作者：
Cohen,JB
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
White,BH;Cohen,JB
Benjamin H. White 和 Jonathan B. Cohen* 华盛顿大学医学院解剖学和神经生物学系，密苏里州圣路易斯 63110 收稿日期：1988 年 5 月 10 日；修订稿于 1988 年 7 月 20 日收到摘要：疏水性光激活探针 3-三氟甲基-3-(间-[125I]碘苯基)二氮丙啶 ([125I]TID) 用于标记从加州鱼雷电器官纯化的富含乙酰胆碱受体的膜。乙酰胆碱受体 (AChR) 的所有四个亚基均被发现含有标记，其中 7 个亚基的掺入量约为其他亚基的 4 倍。氨甲酰胆碱（一种激动剂）和组氨酸毒素（一种非竞争性拮抗剂）均以特异性且剂量依赖性的方式强烈抑制所有 AChR 亚基的标记。相比之下，竞争性拮抗剂α-金环蛇毒素和非竞争性拮抗剂苯环己哌啶对AChR 的[125I] TID 标记仅具有适度的影响。通过金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶消化绘制了包含 [125I] TID 的 AChR a 亚基区域。氨甲酰胆碱敏感的标记位点定位于20-kDa V8切割片段，其起始于Ser-173并且具有足够的长度以包含三个疏水区域M1、M2和M3。从 Asn-339 开始并包含疏水区 M4 的 10-kDa 片段也掺入了 [125I] TID，但以氨甲酰胆碱不敏感的方式掺入。另外两个切割片段共同跨越了α-亚基氨基末端的约三分之一，未掺入可检测到的[125I]TID。作图结果对建议的 AChR 亚基拓扑模型提出了限制。烟碱乙酰胆碱受体 (AChR) 1 是一种完整的膜蛋白，其亚基化学计量为 a2/3yd。已知每个 AChR 亚基都跨膜，并且每个亚基都被认为在结构上对 AChR 离子通道有贡献，该离子通道响应胆碱能激动剂的结合而打开 [Popot 和 Changeux (1984)、Hucho (1986) 和 McCarthy 等人 (1986) 综述]。激动剂和竞争性拮抗剂的结合位点已通过亲和标签定位到α亚基（Kao等人，1984；Pedersen等人，1986；Dennis等人，1988），而高亲和力
Benjamin H. White and Jonathan B. Cohen* Department of Anatomy and Neurobiology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri 63110 Received May 10, 1988; Revised Manuscript Received July 20, 1988 abstract: The hydrophobic, photoactivatable probe 3-trifluoromethyl-3-(m-[125I] iodophenyl) diazirine ([125I] TID) was used to label acetylcholine receptor rich membranes purified from Torpedo californica electric organ. All four subunits of the acetylcholine receptor (AChR) were found to incorporate label, with the 7-subunit incorporating approximately 4 times as much as each of the other subunits. Carbamylcholine, an agonist, and histrionicotoxin, a noncompetitive antagonist, both strongly inhibited labeling of all AChR subunits in a specific and dose-dependent manner. In contrast, the competitive antagonist a-bungarotoxin and the noncompetitive antagonist phencyclidine had only modest effects on [125I] TID labeling of the AChR. The regions of the AChR a-subunit thatincorporate [125I] TID were mapped by Staphylococcus aureus V8 protease digestion. The carbamylcholine-sensitive site of labeling was localized to a 20-kDa V8 cleavage fragment that begins at Ser-173 and is of sufficientlength to contain the three hydrophobic regions Ml, M2, and M3. A 10-kDa fragment beginning at Asn-339 and containing the hydrophobic region M4 also incorporated [125I] TID but in a carbamylcholine-insensitive manner. Two further cleavage fragments, which together span about one-third of the a-subunit amino terminus, incorporated no detectable [125I] TID. The mapping results place constraints on suggested models of AChR subunit topology.The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) 1 is an integral membrane protein with subunit stoichiometry a2/3yd. Each of the AChR subunits is known tospan the membrane, and each is thought to contribute structurally to the AChR ion channel which opens in response to the binding of cholinergic agonists [reviewed by Popot and Changeux (1984), Hucho (1986), and McCarthy et al.(1986)]. The binding sites for agonists and competitive antagonists have been localized to the a-subunits by use of affinity labels (Kao et al., 1984; Pedersen et al, 1986; Dennis et al., 1988), while a high-affinity
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