A non-canonical scaffold-type E3 ligase complex mediates protein UFMylation.
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DOI：
10.15252/embj.2022111015
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发表时间：
2022-11-02
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文献类型：
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作者：
蛋白质UFM化，即，泛素折叠修饰因子1（UFM 1）的翻译后修饰对细胞和内质网的稳态至关重要。尽管它的生物学重要性，我们有一个贫穷的了解UFM 1是如何结合到基板上。在这里，我们使用重建方法来定义蛋白质UFM化的最低要求。我们发现报道的同源E3连接酶UFL 1本身是无活性的，而是需要衔接蛋白UFBP 1来形成活性E3连接酶复合物。结构预测表明，UFL 1/UFBP 1复合物是由翅螺旋（WH）结构域重复。我们发现UFL 1/UFBP 1利用支架型E3连接酶机制，激活UFM 1结合E2酶UFC 1进行氨解。此外，我们表征了第二衔接蛋白CDK 5 RAP 3，其结合到连接酶复合物并形成连接酶复合物的组成部分。出乎意料的是，我们发现CDK 5 RAP 3在体外抑制UFL 1/UFBP 1连接酶活性。重组核糖体UFM化的结果表明，CDK 5 RAP 3作为一个底物接头，指导UFM化的核糖体蛋白RPL 26的功能。总之，我们的重建方法揭示了这种非典型E3连接酶复合物的UFM化和调控原则的生化基础。UFM 1结合的重建显示UFL 1/UFBP 1 E3复合物激活E2 UFC 1进行氨解，并且核糖体单UFM化由CDK 5 RAP 3衔接子促进。
Protein UFMylation, i.e., post‐translational modification with ubiquitin‐fold modifier 1 (UFM1), is essential for cellular and endoplasmic reticulum homeostasis. Despite its biological importance, we have a poor understanding of how UFM1 is conjugated onto substrates. Here, we use a rebuilding approach to define the minimal requirements of protein UFMylation. We find that the reported cognate E3 ligase UFL1 is inactive on its own and instead requires the adaptor protein UFBP1 to form an active E3 ligase complex. Structure predictions suggest the UFL1/UFBP1 complex to be made up of winged helix (WH) domain repeats. We show that UFL1/UFBP1 utilizes a scaffold‐type E3 ligase mechanism that activates the UFM1‐conjugating E2 enzyme, UFC1, for aminolysis. Further, we characterize a second adaptor protein CDK5RAP3 that binds to and forms an integral part of the ligase complex. Unexpectedly, we find that CDK5RAP3 inhibits UFL1/UFBP1 ligase activity in vitro. Results from reconstituting ribosome UFMylation suggest that CDK5RAP3 functions as a substrate adaptor that directs UFMylation to the ribosomal protein RPL26. In summary, our reconstitution approach reveals the biochemical basis of UFMylation and regulatory principles of this atypical E3 ligase complex. Reconstitution of UFM1 conjugation shows that the UFL1/UFBP1 E3 complex activates the E2 UFC1 for aminolysis and that ribosome monoUFMylation is promoted by the CDK5RAP3 adaptor.
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