Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.
Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.
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DOI：
10.1038/nprot.2008.195
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发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
Bulyk, Martha L.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Berger, Michael F.;Bulyk, Martha L.
蛋白质结合微阵列（PBM）技术提供了一种快速、高通量的方法来表征转录因子（TFs）的体外DNA结合特异性。使用高密度、定制设计的包含所有10-mer序列变体的微阵列，可以获得任何TF的综合结合位点测量，而不考虑其结构类别或起源物种。在这里，我们提出了一种使用这种“所有10-mer”通用PBMs在高分辨率下检查和分析TF结合特异性的方案。该程序包括双链商业合成的DNA寡核苷酸阵列，将TF直接结合到双链DNA微阵列上，并用荧光团偶联抗体标记蛋白质结合的微阵列。我们描述了如何在整个亲和范围内，从最高亲和位点到非特异性位点，计算提取所检查的TF对所有可能的连续和间隙8-mers的相对结合偏好。多种蛋白质可以在单个微阵列上的独立室中并行测试，从而可以在一天内处理十几种或更多的tf。
Protein binding microarray (PBM) technology provides a rapid, high-throughput means of characterizing the in vitro DNA binding specificities of transcription factors (TFs). Using high-density, custom-designed microarrays containing all 10-mer sequence variants, one can obtain comprehensive binding site measurements for any TF, regardless of its structural class or species of origin. Here, we present a protocol for the examination and analysis of TF binding specificities at high resolution using such ‘all 10-mer’ universal PBMs. This procedure involves double-stranding a commercially synthesized DNA oligonucleotide array, binding a TF directly to the double-stranded DNA microarray, and labeling the protein-bound microarray with a fluorophore-conjugated antibody. We describe how to computationally extract the relative binding preferences of the examined TF for all possible contiguous and gapped 8-mers over the full range of affinities, from highest affinity sites to nonspecific sites. Multiple proteins can be tested in parallel in separate chambers on a single microarray, enabling the processing of a dozen or more TFs in a single day.
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