Single-cell juxtacellular transfection and recording technique
Single-cell juxtacellular transfection and recording technique
复制标题
单细胞并细胞转染及记录技术
DOI：
10.1007/s00424-013-1304-2
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发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Brigadski T
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Daniel J;Polder H R;Lessmann V;Brigadski T
遗传修饰和药理学研究可以分析活细胞中的蛋白质功能。虽然许多这些研究通过在复杂的细胞网络中大量施用或撤回蛋白质来研究蛋白质的影响，但了解蛋白质功能的更微妙机制需要在单细胞水平上进行微调，而不影响系统的平衡。为了分析单细胞水平上蛋白质修饰的后果，我们开发了一种松散贴片配置的单细胞转染方法，该方法允许在细胞旁转染之前对神经元细胞进行细胞旁记录。根据形态学和电生理学标准选择 CA1 锥体神经元。使用膜片钳放大器，可以在松散密封模式下灵敏地记录动作电流，以及用高压电刺激进行电穿孔，用特定核苷酸的组合转染所识别的神经元，例如siRNA 和编码 GFP 的质粒，用于以后的细胞修复。转染两天后，对转染细胞进行全细胞膜片钳记录以分析电生理特性。单个电穿孔的 CA1 锥体细胞的动作电位放电和突触传递与未转染的细胞相当。我们的研究提出了一种方法，该方法能够在单细胞邻细胞转染之前通过邻细胞记录来识别神经元，从而允许在基因修饰几天后对形态学和电生理学参数进行后续分析。
Genetic modifications and pharmacological studies enable the analysis of protein function in living cells. While many of these studies investigate the effect of proteins by bulk administration or withdrawal of the protein in complex cellular networks, understanding the more subtle mechanisms of protein function requires fine-tuned changes on a single-cell level without affecting the balance of the system. In order to analyse the consequences of protein modification at the single-cell level, we have developed a single-cell transfection method in the loose patch configuration, which allows juxtacellular recordings of neuronal cells prior to juxtacellular transfection. CA1 pyramidal neurons were selected based on morphological and electrophysiological criteria. Using a patch clamp amplifier which allows sensitive recordings of action currents in the loose seal mode as well as electroporation with high-voltage electrical stimulation the identified neurons were transfected with a combination of specific nucleotides, e.g. siRNA and a plasmid coding for GFP for later cell retrieval. Two days after transfection, whole-cell patch clamp recordings of transfected cells were performed to analyse electrophysiological properties. Action potential firing and synaptic transmission of single electroporated CA1 pyramidal cells were comparable to untransfected cells. Our study presents a method which enables identification of neurons by juxtacellular recording prior to single-cell juxtacellular transfection, allowing subsequent analysis of morphological and electrophysiological parameters several days after the genetic modification.
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