An affinity-directed protein missile system for targeted proteolysis.
An affinity-directed protein missile system for targeted proteolysis.
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DOI：
10.1098/rsob.160255
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发表时间：
2016-10
期刊：
影响因子：
5.8
通讯作者：
Sapkota GP
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Fulcher LJ;Macartney T;Bozatzi P;Hornberger A;Rojas-Fernandez A;Sapkota GP
Von Hippel-Lindau(von Hippel-Lindau，von Hippel-Lindau)蛋白在常氧条件下将缺氧诱导因子α(HIF1-α)蛋白募集到CUL2E3泛素连接酶中，通过蛋白酶体进行泛素化和降解。在这篇报道中，我们对VHL进行了改造，设计了一种亲和力定向的蛋白导弹(AdPROM)系统，以指导特定的内源性目标蛋白在哺乳动物细胞中进行蛋白分解。蛋白水解型AdPROM构建的载体含有驼状抗绿色荧光蛋白(AGFP)纳米体，它与VHL融合，可用于结构性表达或四环素诱导表达。对于靶蛋白，我们利用CRISPR/Cas9快速产生了人肾HEK293和U2OS骨肉瘤纯合子敲入细胞，它们分别在Vps34(空泡蛋白分类34)和Smad1相关蛋白(PAWS1，又名FAM83G)座位上含有GFP标签。利用这些细胞，我们证明了VHL-aGFP AdPROM系统的表达导致内源GFP-Vps34和PAWS1-GFP蛋白通过蛋白酶体几乎完全降解。此外，我们还表明，Tet诱导的GFP-Vps34的破坏导致其相关伙伴UVRAG的降解，并降低细胞内磷脂酰肌醇3-磷酸的水平。
The von Hippel–Lindau (VHL) protein serves to recruit the hypoxia-inducible factor alpha (HIF1α) protein under normoxia to the CUL2 E3 ubiquitin ligase for its ubiquitylation and degradation through the proteasome. In this report, we modify VHL to engineer an affinity-directed protein missile (AdPROM) system to direct specific endogenous target proteins for proteolysis in mammalian cells. The proteolytic AdPROM construct harbours a cameloid anti-green fluorescence protein (aGFP) nanobody that is fused to VHL for either constitutive or tetracycline-inducible expression. For target proteins, we exploit CRISPR/Cas9 to rapidly generate human kidney HEK293 and U2OS osteosarcoma homozygous knock-in cells harbouring GFP tags at the VPS34 (vacuolar protein sorting 34) and protein associated with SMAD1 (PAWS1, aka FAM83G) loci, respectively. Using these cells, we demonstrate that the expression of the VHL-aGFP AdPROM system results in near-complete degradation of the endogenous GFP-VPS34 and PAWS1-GFP proteins through the proteasome. Additionally, we show that Tet-inducible destruction of GFP-VPS34 results in the degradation of its associated partner, UVRAG, and reduction in levels of cellular phosphatidylinositol 3-phosphate.
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影响因子：
19
作者：
Funderburk SF;Wang QJ;Yue Z
通讯作者：
Yue Z
DOI：
10.1083/jcb.201409074
发表时间：
2015-06-08
期刊：
The Journal of cell biology
影响因子：
--
作者：
Helma J;Cardoso MC;Muyldermans S;Leonhardt H
通讯作者：
Leonhardt H
影响因子：
3.7
作者：
Li W;Bengtson MH;Ulbrich A;Matsuda A;Reddy VA;Orth A;Chanda SK;Batalov S;Joazeiro CA
通讯作者：
Joazeiro CA
影响因子：
21.3
作者：
Kanai, F;Liu, H;Yaffe, MB
通讯作者：
Yaffe, MB
影响因子：
56.9
作者：
SCHU, PV;TAKEGAWA, K;EMR, SD
通讯作者：
EMR, SD