A directed evolution design of a GCG-specific DNA hemimethylase.
A directed evolution design of a GCG-specific DNA hemimethylase.
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DOI：
10.1093/nar/gkp772
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发表时间：
2009-11
影响因子：
14.9
通讯作者：
Klimasauskas S
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Gerasimaite R;Vilkaitis G;Klimasauskas S
DNA胞嘧啶-5甲基转移酶（C5-MTases）是研究DNA序列特异性修饰的有价值的模型，在生物技术中日益成为重要的工具。在这里，我们描述了一种结构导向的合理蛋白设计，结合随机诱变和选择，将HhaI C5-MTase的特异性从GCGC改变为GCG。特异性的改变是由一个目标识别环内和附近的五个残基缺失和两个精氨酸残基的引入引起的。DNA保护实验、亚硫酸盐测序和酶动力学表明，最佳选择的变异在序列保真度和甲基化效率方面与野生型M.HhaI相当，并且在使用合成辅因子类似物进行DNA转烷基化时取代了亲本酶。设计的C5-MTase可用于在DNA中产生半甲基化的CpG位点，这是研究哺乳动物维持mtase的有价值的底物。
DNA cytosine-5 methyltransferases (C5-MTases) are valuable models to study sequence-specific modification of DNA and are becoming increasingly important tools for biotechnology. Here we describe a structure-guided rational protein design combined with random mutagenesis and selection to change the specificity of the HhaI C5-MTase from GCGC to GCG. The specificity change was brought about by a five-residue deletion and introduction of two arginine residues within and nearby one of the target recognizing loops. DNA protection assays, bisulfite sequencing and enzyme kinetics showed that the best selected variant is comparable to wild-type M.HhaI in terms of sequence fidelity and methylation efficiency, and supersedes the parent enzyme in transalkylation of DNA using synthetic cofactor analogs. The designed C5-MTase can be used to produce hemimethylated CpG sites in DNA, which are valuable substrates for studies of mammalian maintenance MTases.
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