Quantifying inter-organelle membrane contact sites using proximity ligation assay in fixed optic nerve sections.
Quantifying inter-organelle membrane contact sites using proximity ligation assay in fixed optic nerve sections.
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使用固定视神经截面中的接近连接测定法量化轨道间膜接触位点。
DOI：
10.1016/j.exer.2021.108793
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发表时间：
2021-12
影响因子：
3.4
通讯作者：
Yu-Wai-Man P
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Ching J;Osborne A;Eva R;Prudent J;Yu-Wai-Man P
膜接触位点（MCS）在细胞生理学中起着至关重要的作用，几种MCS蛋白的功能障碍与神经和视神经疾病有关。尽管在过去的二十年里，利用先进的电子显微镜技术、超分辨率成像和邻近依赖性荧光报告分子在成像这些相互作用方面取得了显着进展，但尚未报道观察和量化哺乳动物视神经组织中MCS的技术。我们证明了第一次，近接连接试验（PLA），一种技术已经在哺乳动物细胞系中使用，可以用作一种有效的方法，定量细胞器间的接触网站，即内质网（ER）和内质网-内体，在哺乳动物视神经组织处理腺相关病毒（AAV）基因治疗与野生型或磷酸化模拟（活性）的peprodin。PLA利用与二抗结合的互补单链DNA寡聚体，当感兴趣的一抗相互作用时，二抗杂交并完成DNA的环状片段。这些相互作用可以通过扩增环状DNA和添加荧光探针来检测。我们表明，PLA是一种有用的方法，可用于量化MCS在视神经组织。我们已经发现，用基因治疗上调Escherdin显著增加视神经中Eschera-ER和Eschera-Rab 7-late内体接触位点的数量。
Membrane contact sites (MCS) play crucial roles in cell physiology with dysfunction in several MCS proteins being linked with neurological and optic nerve diseases. Although there have been significant advances in imaging these interactions over the past two decades with advanced electron microscopy techniques, super-resolution imaging and proximity-dependent fluorescent reporters, a technique to observe and quantify MCS in mammalian optic nerve tissues has not yet been reported. We demonstrate for the first time that proximity ligation assay (PLA), a technique already used in mammalian cell lines, can be used as an efficient method of quantifying inter-organelle contact sites, namely mitochondria-endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria-late-endosomes, in mammalian optic nerve tissues treated with adeno-associated virus (AAV) gene therapy with wild-type or phosphomimetic (active) protrudin. PLA utilises complementary single-stranded DNA oligomers bound to secondary antibodies that hybridise and complete a circular piece of DNA when the primary antibodies of interest interact. These interactions can be detected by amplifying the circular DNA and adding fluorescent probes. We show that PLA is a useful method that can be used to quantify MCS in optic nerve tissues. We have found that upregulation of protrudin with gene therapy significantly increases the number of mitochondria-ER and mitochondria-Rab7-late endosomes contact sites in optic nerves.
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DOI：
10.1126/science.aan5835
发表时间：
2018-08-03
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Wu H;Carvalho P;Voeltz GK
通讯作者：
Voeltz GK
DOI：
10.1083/jcb.201607099
发表时间：
2016-11-21
期刊：
The Journal of cell biology
影响因子：
--
作者：
Yin X;Kidd GJ;Ohno N;Perkins GA;Ellisman MH;Bastian C;Brunet S;Baltan S;Trapp BD
通讯作者：
Trapp BD
影响因子：
3.7
作者：
Brown, R. Lane;Xiong, Wei-Hong;Duvoisin, Robert M.
通讯作者：
Duvoisin, Robert M.
影响因子：
3.4
作者：
Caminos, Elena;Vaquero, Cecilia F.;Martinez-Galan, Juan R.
通讯作者：
Martinez-Galan, Juan R.
影响因子：
46.9
作者：
Fredriksson, S;Gullberg, M;Landegren, U
通讯作者：
Landegren, U