smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.
smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.
复制标题
RNA 聚合酶 II 转录起始复合物的 smFRET 实验
DOI：
10.1016/j.ymeth.2017.04.011
复制
发表时间：
2017
期刊：
影响因子：
4.8
通讯作者：
J. Michaelis
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
N. Malkusch;T. Dörfler;J. Nagy;T. Eilert;J. Michaelis
单分子荧光，特别是单分子Förster共振能量转移（smFRET）是一个强大的工具，提供实时的大分子结构，如真核生物转录起始复合物的动态结构的信息。与其他结构生物学方法相比，不仅揭示了结构细节，还揭示了动力学转变，从而接近了潜在的分子机制。在这里，我们描述了一个全面的定量生物物理工具箱，可用于严格的动态蛋白质-核酸复合物的分析，并适用于真核生物转录起始的研究。我们目前的最小真核生物转录起始复合物的所有必要的蛋白质组分的纯化的详细协议。此外，我们展示了如何精心策划的策略，位点特异性的蛋白质标记可以用来产生与染料分子连接到任意所需的位置的复合物。然后将这些复合物用于smFRET测量。此外，我们描述了纳米定位系统（Nano-Positioning System），它使我们能够定量地使用smFRET测量网络的结果来获得结构信息。有了这个，我们提供了一个工具箱来回答无法使用X射线晶体学或低温电子显微镜等方法解决的开放性问题。
Single-molecule fluorescence and in particular single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) is a powerful tool to provide real-time information on the dynamic architecture of large macromolecular structures such as eukaryotic transcription initiation complexes. In contrast to other structural biology methods, not only structural details, but dynamics transitions are revealed thus closing in on the underlying molecular mechanisms. Here, we describe a comprehensive quantitative biophysical toolbox which can be used for rigorous analysis of dynamic protein-nucleic acid complexes and is applied to the study of eukaryotic transcription initiation. We present detailed protocols for the purification of all essential protein components of the minimal eukaryotic transcription initiation complex. Moreover, we demonstrate how elaborate strategies for site-specific protein labeling can be used to produce complexes with dye molecules attached to arbitrary desired positions. These complexes are then used for smFRET measurements. Moreover, we describe the Nano-Positioning System (NPS) which allows us to quantitatively use the results from a network of smFRET measurements to obtain structural information. With this we provide a toolbox to answer open questions which could not be addressed using methods like X-ray crystallography or cryo-electron microscopy.
登录
查看更多内容
RNA 聚合酶 I 和 II 的回溯恢复机制
DOI：
10.1073/pnas.1517011113
发表时间：
2016-03-15
影响因子：
11.1
作者：
Lisica, Ana;Engel, Christoph;Grill, Stephan W.
通讯作者：
Grill, Stephan W.
影响因子：
6.8
作者：
Nogales, Eva;Louder, Robert K.;He, Yuan
通讯作者：
He, Yuan
影响因子：
48
作者：
Muschielok, Adam;Andrecka, Joanna;Michaelis, Jens
通讯作者：
Michaelis, Jens
影响因子：
14.9
作者：
Lewis R;Dürr H;Hopfner KP;Michaelis J
通讯作者：
Michaelis J
通过活酵母细胞中的单个内源基因直接观察单个 RNA 聚合酶的加工过程。
影响因子：
--
作者：
B. Treutlein;J. Michaelis
通讯作者：
J. Michaelis