A Toolbox for Site-Specific Labeling of RecQ Helicase With a Single Fluorophore Used in the Single-Molecule Assay.
A Toolbox for Site-Specific Labeling of RecQ Helicase With a Single Fluorophore Used in the Single-Molecule Assay.
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用于单分子测定中使用的单一荧光团对 RecQ 解旋酶进行位点特异性标记的工具箱
DOI：
10.3389/fmolb.2020.586450
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发表时间：
2020
影响因子：
5
通讯作者：
Xu Y
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Teng FY;Jiang ZZ;Huang LY;Guo M;Chen F;Hou XM;Xi XG;Xu Y
生物标记蛋白质可以提高检测灵敏度，已广泛应用于各种生物检测中。在单分子测定中，蛋白质的位点特异性标记使得能够可视化分子相互作用、蛋白质的构象变化和酶活性。在这项研究中，基于大肠杆菌RecQ解旋酶中的柔性接头，我们建立了一种涉及荧光团标记和分选酶A连接的组合的方案，以允许用单个Cy5荧光团对RecQ的HRDC结构域进行位点特异性标记，而不引入额外的荧光结构域或肽片段。利用单分子荧光共振能量转移技术，我们首次观察到Cy5标记的HRDC可以直接与RecA结构域相互作用，并可以在体外动态地结合到突出端DNA的3′和5′端。本工作不仅揭示了HRDC结构域的功能机制，而且为单分子检测中使用的单荧光团位点特异性标记结构域提供了可行的方法。
Fluorescently labeled proteins can improve the detection sensitivity and have been widely used in a variety of biological measurements. In single-molecule assays, site-specific labeling of proteins enables the visualization of molecular interactions, conformational changes in proteins, and enzymatic activity. In this study, based on a flexible linker in the Escherichia coli RecQ helicase, we established a scheme involving a combination of fluorophore labeling and sortase A ligation to allow site-specific labeling of the HRDC domain of RecQ with a single Cy5 fluorophore, without inletting extra fluorescent domain or peptide fragment. Using single-molecule fluorescence resonance energy transfer, we visualized that Cy5-labeled HRDC could directly interact with RecA domains and could bind to both the 3′ and 5′ ends of the overhang DNA dynamically in vitro for the first time. The present work not only reveals the functional mechanism of the HRDC domain, but also provides a feasible method for site-specific labeling of a domain with a single fluorophore used in single-molecule assays.
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影响因子：
16.6
作者：
Croteau DL;Popuri V;Opresko PL;Bohr VA
通讯作者：
Bohr VA
DOI：
10.1002/anie.201505277
发表时间：
2015-09-28
期刊：
Angewandte Chemie (International ed. in English)
影响因子：
--
作者：
Li Z;Theile CS;Chen GY;Bilate AM;Duarte JN;Avalos AM;Fang T;Barberena R;Sato S;Ploegh HL
通讯作者：
Ploegh HL
影响因子：
4.6
作者：
Ohana, Rachel Friedman;Hurst, Robin;Wood, Keith, V
通讯作者：
Wood, Keith, V
影响因子：
13.8
作者：
Morozov, V;Mushegian, AR;Bork, P
通讯作者：
Bork, P
DOI：
10.1073/pnas.0908640106
发表时间：
2009-12-15
影响因子：
11.1
作者：
Christian, Thomas D.;Romano, Louis J.;Rueda, David
通讯作者：
Rueda, David