Efficient Inactivation of Symbiotic Nitrogen Fixation Related Genes in Lotus japonicus Using CRISPR-Cas9.
Efficient Inactivation of Symbiotic Nitrogen Fixation Related Genes in Lotus japonicus Using CRISPR-Cas9.
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使用 CRISPR-Cas9 有效灭活莲花共生固氮相关基因。
DOI：
10.3389/fpls.2016.01333
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发表时间：
2016
影响因子：
5.6
通讯作者：
Duanmu D
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Wang L;Wang L;Tan Q;Fan Q;Zhu H;Hong Z;Zhang Z;Duanmu D
靶向基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统已被广泛用于以可预测和精确的方式修饰感兴趣的基因。在这项研究中，我们描述了CRISPR/Cas9介导的高效编辑代表性SNF（共生固氮）相关基因的模式豆科植物百脉根通过农杆菌介导的稳定或毛状根转化。我们首先预测了9个Lotus中的内源U6基因，然后通过使用分裂黄色荧光蛋白（YFP）报告系统恢复拟南芥原生质体中的荧光来证明LjU 6 -1基因启动子在驱动单向导RNA（sgRNA）表达中的功效。接下来，我们选择了一种定制的sgRNA靶向SYMRK（共生受体样激酶）基因座，并在20株T0转基因植物中实现了约35%的诱变效率，其中两株含有双等位基因纯合突变，在PAM区域附近缺失2-bp。我们进一步设计了两个靶向三个同源豆血红蛋白基因座（LjLb 1、LjLb 2、LjLb 3）的sgRNA，用于测试产生多基因敲除的可能性。在70株毛状根转基因植物中，有20株表现出白色结节，每株植物中至少有两个LjLbs被破坏。与组成型活性CaMV 35 S启动子相比，根瘤特异性LjLb 2启动子在通过毛状根转化的根瘤中的基因编辑中也是有效的。还通过使用两种sgRNA的稳定转化获得LjLbs的三重突变体敲除。总的来说，这些研究表明CRISPR/Cas9系统应该极大地促进莲花中SNF相关基因的功能分析。
The targeted genome editing technique, CRISPR/Cas9 system, has been widely used to modify genes of interest in a predictable and precise manner. In this study, we describe the CRISPR/Cas9-mediated efficient editing of representative SNF (symbiotic nitrogen fixation) related genes in the model legume Lotus japonicus via Agrobacterium-mediated stable or hairy root transformation. We first predicted nine endogenous U6 genes in Lotus and then demonstrated the efficacy of the LjU6-1 gene promoter in driving expression of single guide RNAs (sgRNAs) by using a split yellow fluorescence protein (YFP) reporter system to restore the fluorescence in Arabidopsis protoplasts. Next, we chose a customized sgRNA targeting SYMRK (symbiosis receptor-like kinase) loci and achieved ~35% mutagenic efficiency in 20 T0 transgenic plants, two of them containing biallelic homozygous mutations with a 2-bp deletion near the PAM region. We further designed two sgRNAs targeting three homologous leghemoglobin loci (LjLb1, LjLb2, LjLb3) for testing the possibility of generating multi-gene knockouts. 20 out of 70 hairy root transgenic plants exhibited white nodules, with at least two LjLbs disrupted in each plant. Compared with the constitutively active CaMV 35S promoter, the nodule-specific LjLb2 promoter was also effective in gene editing in nodules by hairy root transformation. Triple mutant knockout of LjLbs was also obtained by stable transformation using two sgRNAs. Collectively, these studies demonstrate that the CRISPR/Cas9 system should greatly facilitate functional analyses of SNF related genes in Lotus japonicus.
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影响因子：
46.9
作者：
Doench JG;Fusi N;Sullender M;Hegde M;Vaimberg EW;Donovan KF;Smith I;Tothova Z;Wilen C;Orchard R;Virgin HW;Listgarten J;Root DE
通讯作者：
Root DE
影响因子：
27.5
作者：
Ma, Xingliang;Zhang, Qunyu;Liu, Yao-Guang
通讯作者：
Liu, Yao-Guang
影响因子：
11.6
作者：
Chen, Tao;Zhu, Hui;Zhang, Zhongming
通讯作者：
Zhang, Zhongming
DOI：
10.1126/science.1232033
发表时间：
2013-02-15
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Mali P;Yang L;Esvelt KM;Aach J;Guell M;DiCarlo JE;Norville JE;Church GM
通讯作者：
Church GM
DOI：
10.1073/pnas.0409339102
发表时间：
2005-02-08
影响因子：
11.1
作者：
Lloyd, A;Plaisier, CL;Drews, GN
通讯作者：
Drews, GN