Quantifying Kinase-Specific Phosphorylation Stoichiometry Using Stable Isotope Labeling In a Reverse In-Gel Kinase Assay.
Quantifying Kinase-Specific Phosphorylation Stoichiometry Using Stable Isotope Labeling In a Reverse In-Gel Kinase Assay.
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DOI：
10.1021/acs.analchem.6b02599
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发表时间：
2016-12-06
影响因子：
7.4
通讯作者：
Bieberich, Charles J.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Li, Xiang;Cox, Jonathan T.;Huang, Weiliang;Kane, Maureen;Tang, Keqi;Bieberich, Charles J.
尽管大规模磷酸化蛋白质组学最近取得了进展，但仍缺乏量化蛋白质底物激酶特异性磷酸化化学计量的方法。我们开发了一种通过将反向凝胶内激酶测定 (RIKA) 与高分辨率 LC-MS 相结合来量化激酶特异性磷酸化化学计量的方法。从磷酸化与非磷酸化蛋白激酶 CK2 (CK2) 底物分子的预定比例开始，我们采用 18O-ATP 作为 RIKA 中的磷酸盐供体，然后使用高质量准确度 MS 定量 18O 与 16O 标记的胰蛋白酶磷酸肽的比例。我们证明，通过该方法在广泛的磷酸化百分比范围内确定的磷酸化化学计量与预测值具有极好的相关性（相关系数 = 0.99）。该方法为基于抗体的确定底物库磷酸化程度的方法提供了定量替代方法。
Despite recent advancements in large-scale phospho-proteomics, methods to quantify kinase-specific phosphorylation stoichiometry of protein substrates are lacking. We developed a method to quantify kinase-specific phosphorylation stoichiometry by combining the reverse in-gel kinase assay (RIKA) with high resolution LC-MS. Beginning with predetermined ratios of phosphorylated to non-phosphorylated Protein Kinase CK2 (CK2) substrate molecules, we employed 18O-ATP as the phosphate donor in a RIKA, then quantified the ratio of 18O-versus 16O-labeled tryptic phosphopeptide using high mass accuracy MS. We demonstrate that the phosphorylation stoichiometry determined by this method across a broad percent phosphorylation range correlated extremely well with the predicted value (correlation coefficient =0.99). This approach provides a quantitative alternative to antibody-based methods of determining the extent of phosphorylation of a substrate pool.
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影响因子：
64.5
作者：
Huttlin EL;Jedrychowski MP;Elias JE;Goswami T;Rad R;Beausoleil SA;Villén J;Haas W;Sowa ME;Gygi SP
通讯作者：
Gygi SP
DOI：
10.1016/j.bbapap.2013.03.009
发表时间：
2014-01
影响因子：
3.2
作者：
Hu, Jianfei;Rho, Hee-Sool;Newman, Robert H.;Hwang, Woochang;Neiswinger, John;Zhu, Heng;Zhang, Jin;Qian, Jiang
通讯作者：
Qian, Jiang
影响因子：
4.8
作者：
Padmanabhan, Achuth;Li, Xiang;Bieberich, Charles J.
通讯作者：
Bieberich, Charles J.
影响因子：
7.3
作者：
Olsen, Jesper V.;Vermeulen, Michiel;Mann, Matthias
通讯作者：
Mann, Matthias
影响因子：
4.4
作者：
Jin, Lily L.;Tong, Jiefei;Moran, Michael F.
通讯作者：
Moran, Michael F.