Multiplex Gene Tagging with CRISPR-Cas9 for Live-Cell Microscopy and Application to Study the Role of SARS-CoV-2 Proteins in Autophagy, Mitochondrial Dynamics, and Cell Growth.
Multiplex Gene Tagging with CRISPR-Cas9 for Live-Cell Microscopy and Application to Study the Role of SARS-CoV-2 Proteins in Autophagy, Mitochondrial Dynamics, and Cell Growth.
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DOI：
10.1089/crispr.2021.0041
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发表时间：
2021-12
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Rico MC
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Perez-Leal O;Nixon-Abell J;Barrero CA;Gordon JC;Oesterling J;Rico MC
缺乏有效的工具来标记细胞系中的多种内源性靶标而不进行染色或固定，这限制了我们通过活细胞研究随时间推移跟踪细胞中生理和病理变化的能力。在这里，我们概述了与CRISPR-Cas9组合使用的FAST-HDR载体系统，以允许对同一细胞系中多达三种内源性蛋白质进行可视化活细胞研究。我们的方法利用一组新的先进供体质粒进行同源性定向修复，并优化了基于显微镜的细胞筛选的简化工作流程，以创建不需要染色或固定的遗传修饰细胞系，以适应基于显微镜的研究。我们通过开发两种先进的细胞系来验证这种新方法，这些细胞系具有三种荧光标记的内源性蛋白质，这些蛋白质支持高含量成像，而不使用抗体或外源性染色。我们应用该技术研究了7种严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2/COVID-19）病毒蛋白，以更好地了解它们对自噬，线粒体动力学和细胞生长的影响。使用这两种细胞系，我们能够成功地将蛋白质ORF 3a鉴定为自噬的有效抑制剂、线粒体重新定位的诱导剂和生长抑制剂，这突出了使用该技术进行活细胞研究的有效性。
The lack of efficient tools to label multiple endogenous targets in cell lines without staining or fixation has limited our ability to track physiological and pathological changes in cells over time via live-cell studies. Here, we outline the FAST-HDR vector system to be used in combination with CRISPR-Cas9 to allow visual live-cell studies of up to three endogenous proteins within the same cell line. Our approach utilizes a novel set of advanced donor plasmids for homology-directed repair and a streamlined workflow optimized for microscopy-based cell screening to create genetically modified cell lines that do not require staining or fixation to accommodate microscopy-based studies. We validated this new methodology by developing two advanced cell lines with three fluorescent-labeled endogenous proteins that support high-content imaging without using antibodies or exogenous staining. We applied this technology to study seven severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2/COVID-19) viral proteins to understand better their effects on autophagy, mitochondrial dynamics, and cell growth. Using these two cell lines, we were able to identify the protein ORF3a successfully as a potent inhibitor of autophagy, inducer of mitochondrial relocalization, and a growth inhibitor, which highlights the effectiveness of live-cell studies using this technology.
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改善绿色和红色荧光蛋白的亮度和光稳定性，用于活细胞成像和FRET报告。
影响因子：
4.6
作者：
Bajar BT;Wang ES;Lam AJ;Kim BB;Jacobs CL;Howe ES;Davidson MW;Lin MZ;Chu J
通讯作者：
Chu J
预测和识别基因组编辑中的附带损害
DOI：
10.1016/j.tig.2020.09.011
发表时间：
2020-12
期刊：
Trends in genetics : TIG
影响因子：
--
作者：
Burgio G;Teboul L
通讯作者：
Teboul L
DOI：
10.1038/s41579-018-0003-6
发表时间：
2018-06
期刊：
Nature reviews. Microbiology
影响因子：
--
作者：
Choi Y;Bowman JW;Jung JU
通讯作者：
Jung JU
影响因子：
48
作者：
Gibson, Daniel G.;Young, Lei;Smith, Hamilton O.
通讯作者：
Smith, Hamilton O.
β-核心就是使用溶酶体进行出口，而不是生物合成分泌途径。
影响因子：
64.5
作者：
Ghosh S;Dellibovi-Ragheb TA;Kerviel A;Pak E;Qiu Q;Fisher M;Takvorian PM;Bleck C;Hsu VW;Fehr AR;Perlman S;Achar SR;Straus MR;Whittaker GR;de Haan CAM;Kehrl J;Altan-Bonnet G;Altan-Bonnet N
通讯作者：
Altan-Bonnet N