Unmixing of fluorescence spectra to resolve quantitative time-series measurements of gene expression in plate readers.
Unmixing of fluorescence spectra to resolve quantitative time-series measurements of gene expression in plate readers.
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DOI：
10.1186/1472-6750-14-11
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发表时间：
2014-02-03
影响因子：
3.5
通讯作者：
Swain PS
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lichten CA;White R;Clark IB;Swain PS
为了将基因表达与细胞生理学联系起来，我们需要跟踪蛋白质水平随时间的变化。实验通常使用绿色荧光蛋白（GFP）的变体，如果要跟踪单细胞，则时间序列测量需要专业知识。然而，作为许多实验室的标准，荧光板读数器原则上可以提供类似的数据，尽管是在平均群体水平上。然而，提取每个细胞的平均荧光是具有挑战性的，因为自发荧光可能是大量的。在这里，我们提出了一个通用的方法，用于校正板读取器测量的荧光蛋白，使用光谱解混，并确定每个细胞的荧光和错误的荧光。结合菌株收集，如GFP融合收集芽殖酵母，我们的方法允许定量测量蛋白质水平的高达数百个基因，因此提供了补充数据的高通量转录研究。我们说明了以下的GAL基因在酿酒酵母中的诱导超过20小时，在不同的糖的方法，并认为该顺序的外观的Leloir酶可能是为了减少积累的有毒中间半乳糖-1-磷酸。此外，在细胞经历碳源变化（从甘油到葡萄糖）后，我们再次在20小时内定量了超过40个基因的蛋白质水平。我们的方法是敏感的，可扩展的，并应适用于其他生物体。通过允许在数十小时内对每个细胞和数百个基因进行定量测量，它应该增加我们对驱动细胞行为的动态变化的理解。
To connect gene expression with cellular physiology, we need to follow levels of proteins over time. Experiments typically use variants of Green Fluorescent Protein (GFP), and time-series measurements require specialist expertise if single cells are to be followed. Fluorescence plate readers, however, a standard in many laboratories, can in principle provide similar data, albeit at a mean, population level. Nevertheless, extracting the average fluorescence per cell is challenging because autofluorescence can be substantial. Here we propose a general method for correcting plate reader measurements of fluorescent proteins that uses spectral unmixing and determines both the fluorescence per cell and the errors on that fluorescence. Combined with strain collections, such as the GFP fusion collection for budding yeast, our methodology allows quantitative measurements of protein levels of up to hundreds of genes and therefore provides complementary data to high throughput studies of transcription. We illustrate the method by following the induction of the GAL genes in Saccharomyces cerevisiae for over 20 hours in different sugars and argue that the order of appearance of the Leloir enzymes may be to reduce build-up of the toxic intermediate galactose-1-phosphate. Further, we quantify protein levels of over 40 genes, again over 20 hours, after cells experience a change in carbon source (from glycerol to glucose). Our methodology is sensitive, scalable, and should be applicable to other organisms. By allowing quantitative measurements on a per cell basis over tens of hours and over hundreds of genes, it should increase our understanding of the dynamic changes that drive cellular behaviour.
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影响因子：
48
作者：
Gordon, Andrew;Colman-Lerner, Alejandro;Brent, Roger
通讯作者：
Brent, Roger
影响因子：
5.3
作者：
HWANG, PK;TUGENDREICH, S;FLETTERICK, RJ
通讯作者：
FLETTERICK, RJ
影响因子：
3.2
作者：
FU, LW;BOUNELIS, P;BEDWELL, DM
通讯作者：
BEDWELL, DM
DOI：
10.1093/bioinformatics/btn562
发表时间：
2008-12-15
期刊：
Bioinformatics (Oxford, England)
影响因子：
--
作者：
Finkenstädt B;Heron EA;Komorowski M;Edwards K;Tang S;Harper CV;Davis JR;White MR;Millar AJ;Rand DA
通讯作者：
Rand DA
影响因子：
9.9
作者：
Berthoumieux, Sara;de Jong, Hidde;Geiselmann, Johannes
通讯作者：
Geiselmann, Johannes